Eine Analyse der Effizienz der Identifizierung der botanischen und entomologischen Zusammensetzung von Honig durch verschiedene Primer, die bei der Metabarkodierung an mehreren Orten verwendet werden

Stipendiatin/Stipendiat: Cornelia Paula Gavris

Die Bestäubung spielt eine entscheidende Rolle für das Funktionieren aller terrestrischen Ökosysteme. Weltweit sind viele landwirtschaftlichen und gärtnerischen Kulturen von der Bestäubung durch Tiere abhängig, wobei Gemüse und Obst am meisten davon betroffen sind. Honigbienen und andere Insekten wie Hummeln, Pollenwespen, Ameisen und viele andere tragen direkt als Bestäuber sowohl von Wild- als auch von Nutzpflanzen bei. Nicht alle tierabhängigen Bestäubungen werden von den Honigbienen durchgeführt, aber die Tatsache, dass sie eine Vielzahl von Blumenarten besuchen, durchschnittlich 4,5 km zu Futterzwecken zurücklegen können und die Fähigkeit haben, anderen im Bienenstock den Standort der Blumenressourcen mitzuteilen, macht sie zu besonders effizienten Bestäubern. Außerdem sind die Honigbienen im Vergleich zu anderen Bestäubern durch ihre einfache Handhabung ideal für die Bestäubung von Pflanzen. Neben ihrem Beitrag als Bestäuber produzieren die Honigbienen auch Honig, der von den Menschen seit dem Altertum konsumiert wird und der für seinen Nährwert, seine antiseptischen und antibiotischen Eigenschaften bekannt und geschätzt ist. Der Honig kann aus Blütennektar (Honig) oder aus Ausscheidungen von Blattläusen, einem Insekt der Hemiptera-Ordnung, gewonnen werden (Honigtauhonig). Die Pollenkörner bleiben während der Futtersuche an den Honigbienen haften und bei der Honigherstellung werden z.t. versehentlich Pollenkörner hinzugefügt. Der Honig wird entweder als einblumig (eine botanische Quelle) oder mehrblumig (mehrere botanische Quellen) klassifiziert. Der Wert des Honigs kann je nach seiner botanischen Zusammensetzung schwanken (z.B. 250 Gramm Manuka-Honig, der von zwei Leptospermum-Arten stammt, wird um 30$ geschätzt) und die Bienenart, die ihn produziert (z.B. Honig von stachellosen Bienen (Melipona beecheii) wird sehr geschätzt, da sie nur 1-2 Liter Honig pro Bienenstock und Jahr produziert). Aus diesen Gründen wird der Honig oft verfälscht. Die Melissopalynologie ist die traditionelle Methode zur Identifizierung der botanischen Herkunft des Honigs und wird zur Bekämpfung von Betrug und falscher Kennzeichnung eingesetzt. Sie besteht darin, die Pollen im Honig mit Hilfe der Lichtmikroskopie zu untersuchen und die botanische Quelle anhand der morphologischen Merkmale zu identifizieren.

Ein weiterer vielversprechender Ansatz ist DNA-Metabarcoding. Mit Metabarcoding ist es möglich, Honigproben, die auch aus mehreren DNA-Quellen (botanische und/oder entomologische Quelle) stammen, durch eine DNA-Analyse zu analysieren. Die Identifizierung von Pflanzen- und/oder Insektenquellen erfolgt durch die Amplifikation spezifischer molekularer Regionen, deren Sequenzierung, und dem Vergleich der erhaltenen Sequenzen mit einer Referenzdatenbank.

Aus genetischer Sicht kann die im Honig vorhandene DNA entweder aus den im Honig eingebetteten Pollenkörnern oder aus der flüssigen Fraktion extrahiert werden. Die meisten Studien zum Metabarcoding von Honig beziehen sich auf die DNA-Extraktion nur aus dem Pollenkorn. Aufgrund der Ernährung der Honigbiene (Pollen oder Honigtau) und des Produktionsprozesses der Honigbiene (Aufstoßen und enzymatische Aktivität) wird vermutet, dass Spuren von DNA aus ihrer Nahrung auch in der flüssigen Fraktion, unter der DNA aus geplatzten Pollenkörnern, zu finden sind.

In dieser Studie wollen wir zum ersten Mal durch einen DNA-Metabarcoding-Ansatz das Pollenmaterial im Honig identifizieren und mit dem Nicht-Pollenmaterial (Nektar und/oder Honigtau) vergleichen, sowie die Hemipteran-Insektenspuren (Quelle des Honigtaus) im Honig identifizieren.

Dazu habe ich 18 Honigproben ausgewählt, um DNA zu isolieren, drei DNA-Barcode-Regionen zu amplifizieren und eine Illumina-NGS-Sequenzierung durchzuführen. . Honigproben wurden mit ddH2O verdünnt, das auf 65°C vorgewärmt war, und zentrifugiert, um den Pollen (Pollenpellet) vom Nektaranteil (flüssige Fraktion) abzutrennen. Danach wurde das resuspendierte Pollenpellet filtriert, so dass die Nektarspuren größtenteils oder vollständig vom Pellet entfernt wurden. Aus allen 36 Proben (filtrierte Pollenpellets und flüssige Fraktionen) wurde mit dem NucleoSpin®Food Kit (Macherey-Nagel, Deutschland) mit geringfügigen Modifikationen eine erfolgreiche DNA-Isolierung durchgeführt. 

Für die Identifizierung von Pflanzen und Insekten auf Artenebene wurden drei spezifisch gestaltete DNA-Barcode-Regionen ausgewählt:

• Zur botanischen Identifizierung

1. Die nukleare interne transkribierte Spacer-Region 2 (ITS2)

2. Der intergene Spacer Plastid trnl-trnf (P6loop)

• Zur entomologischen Identifizierung der Blattlausart

3. Die mitochondriale Cytochrom-C-Oxidase-Untereinheit I (CO1)

Für die ITS2- und P6loop-Primerpaare wurden verschiedene Reagenzien Mengen und Thermocycler-Bedingungen getestet, um die optimalen PCR-Bedingungen zu bestimmen.Um die zu sequenzieren den ITS2-PCR-Produkte herzustellen, wurde die PCR dreifach sowohl für das filtrierte Pollenpellet als auch für die Proben der flüssigen Fraktion durchgeführt. Die ITS2-PCR-Produkte wurden auf einem 2% igen Agarosegel sichtbar gemacht, um die Amplifikation Qualität der Primerpaare zu überprüfen und um sicherzustellen, dass keine Kontamination aufgetreten ist. 5 µl von jedem dreifachen PCR-Produkt wurden danach in einem Endvolumen von 15 µl zusammengefasst, mit ExoI gereinigt und zur Illumina-Sequenzierung an die Firma LGC geschickt. Das PCR-Protokoll der P6loop-Primerpaare wird festgelegt, und es müssen PCR-Dreifachuntersuchungen der filtrierten Pollenpellet- und Flüssigfraktionsproben durchgeführt werden. Die DNA der Hemipteran-Spezies wurde extrahiert und mit dem CO1-Primerpaar amplifiziert. Um die Spezies zu bestätigen und zu identifizieren, wird eine Sanger-Sequenzierung nur an den Proben durchgeführt, die durch die CO1-Primer amplifiziert wurden. Sobald die Art identifiziert ist, wird die DNA als positive Blattlauskontrolle verwendet. Der Aufbau und die Bedingungen der CO1-PCR müssen noch optimiert werden, um eine bessere Amplifikation der Proben zu gewährleisten. Sobald die CO1-PCR-Triplikate realisiert sind, werden 5 µl der PCR-Produkte jedes Triplikats zusammen mit den P6loop-Triplikaten in einem Endvolumen von 30 µl gepoolt und mit ExoI aufgereinigt und zur Illumina-Sequenzierung an die LGC-Firma gesendet. Nach der Sequenzierung werden die resultierenden Messwerte zusammengeführt, gefiltert und die Pflanzen- und Blattlausarten werden unter Verwendung vorhandener Pipelines mit Ergänzungen aus unserem Labor identifiziert.

Förderzeitraum:
18.08.2019 - 17.02.2020

Institut:
Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut für Botanik
AG Spezielle Botanik

Betreuer:
Prof. Dr. Birgit Gemeinholzer

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