Biosynthesis and biological significance of the cyanobacterial metabolites Ambigol A and B
Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine neue Technik zur Klonierung und Expression von Naturstoff-Biosynthese-Genclustern (BGCs) mitentwickelt und um eine einfache, mRNA-unabhängige Methode zur Kontrolle auf vollständige Gentranskription direkt während der heterologen Expression erweitert. Direct Pathway Cloning (DiPaC) ermöglicht die Integration kleiner bis mittelgroßer Gencluster direkt in für die heterologe Expression geeignete Vektoren. Die entsprechende DNA-Sequenz kann schon während dieses Prozesses modifiziert werden, beispielsweise durch Addition, Austausch oder Deletion genomischer Regulatoren wie Promotoren und Terminatoren, oder durch das Vertauschen der Reihenfolge einzelner Gene. Die Eignung von DiPaC zur Klonierung anspruchsvoller Sekundärmetabolit-BGCs wurde anhand dreier Beispiele demonstriert.
Die cyanobakteriellen, hexapeptidischen Anabaenopeptine sind Proteaseinhibitoren, welche in verschiedenen Varianten von mehreren Cyanobakterien synthetisiert werden. Nostoc punctiforme PCC 73102 stellt die beiden L-Homophenylalanin (L-Hph) und L-Homotyrosin (L-Hty) enthaltenden Varianten Anabaenopeptin NZ857 und Nostamide A her, welche auf dem 29,2 kb großen apt Gencluster codiert sind. Die für die Homoaminosäure-Biosynthese verantwortlichen Gene befinden sich up- und downstream der zentralen nichtribosomalen Peptidsynthetase-(NRPS)Einheit, welche aus vier Genen besteht und für den Aufbau und die Zyklisierung des finalen Produkts verantwortlich ist. Unter Verwendung von DiPaC konnte das apt BGC aufgeteilt und in zwei verschiedene Expressionsplasmide integriert werden. Dadurch war eine unabhängige Expressionsinduktion der Vorstufen-synthetisierenden Enzyme und anschließend der assemblierenden NRPS-Maschinerie möglich. Diese Strategie führte zur ersten erfolgreichen Produktion von Anabaenopeptin NZ857 und Nostamide A in dem hetererologen Expressionsstamm Escherichia coli BAP1.
Sodorifen ist eine volatile organische Verbindung (VOC) mit bisher unbekannter biologischer Aktivität, welche von verschiedenen Serratia plymuthica Stämmen produziert wird. S. plymuthica WS3236 enthält ein potentielles, 4,6 kb großes Sodorifen-Cluster (sod), welches mit DiPaC kloniert und anschließend durch heterologe Expression in E. coli BL21 verifiziert wurde. Gleichzeitig wurde ein erfolgreiches Transkriptions-Reportersystem entwickelt, welches auf dem C-terminal angefügten, grün fluoreszierenden Protein (GFP) basiert. Durch Variation der Kultivierungsbedingungen konnte eine 26-fach höhere, heterologe Sodorifenproduktion im Vergleich zum Wildtyp-Stamm erzielt werden, wobei die Reinheit der Substanz im Rohextrakt bei über 90% lag.
Ambigole sind polychlorierte Naturstoffe, welche von Fischerella ambigua 108b synthetisiert werden. Sie weisen interessante antibakterielle, antimykotische und zytotoxische Aktivitäten auf. Bisher wurden drei Derivate, Ambigol A-C, beschrieben. Sie bestehen aus drei Dichlorphenol-Einheiten, welche über Biaryl- und Biaryletherbindung verknüpft sind und weisen ungewöhnliche Bindungskonnektivitäten auf. Die beiden Chloratome an der zentralen Phenol-Einheit von Ambigol A und B befinden sich in relativer meta Position. Bei Ambigol C liegen die Biaryletherbindungen, welche die drei Phenole miteinander verbinden, in relativer meta Position zur Hydroxygruppe des zentralen Phenols vor. Bisher ist keine enzymatische Reaktion bekannt, welche entweder die Biarylbindungen oder die Chloratome in diesen Positionen erklären konnte. Daher wurde die Ambigol-Biosynthese im Rahmen dieser Arbeit auf mehreren Ebenen untersucht.
Die vorangegangene, bioinformatische Identifikation des potentiellen, 14,3 kb großen Ambigol (ab) BGCs in F. ambigua wurde auf Basis neuester genomischer Datensätze aktualisiert. Die Identität des ab Clusters wurde durch heterologe Expression in dem cyanobakteriellen Wirtssystem Synechococcus elongatus PCC 7942 bestätigt. Die zur natürlichen Transformation von Cyanobakterien verwendete Methode musste hierfür weiter entwickelt werden, da die Integration derart langer DNA-Fragmente in das Genom von Synechococcus bisher nicht beschrieben wurde. Unter Verwendung von DiPaC konnte, durch das Halbieren des ab Clusters und die aufeinanderfolgende Integration beider Teile in verschiedene neutrale Stellen innerhalb des Chromosoms von S. elongatus, erfolgreich eine Doppelmutante erstellt werden, welche mindestens ein Ambigol-Derivat synthetisiert. Das ab Cluster enthält die beiden Cytochrom P450 Enzyme Ab2 und Ab3, von welchen anzunehmen ist, dass sie für die Installation aller Biaryl- und Biaryletherbindungen in den Ambigolen verantwortlich sind. Die enzymatische Reaktivität beider Proteine wurden mithilfe verschiedener Ansätze charakterisiert. Im Anschluss an die heterologe Expression in E. coli BL21 und die darauf folgende Reinigung wurden in vitro Assays mit dem potentiellen Substrat 2,4-Dichlorphenol (2,4-DCP) durchgeführt. Die Strukturen der Reaktionsprodukte wurden durch Vergleiche mit chemisch synthetisierten Standards aufgeklärt. Ab2 katalysiert die Bildung eines Biarylether-verknüpften Dimers, während Ab3 hauptsächlich ein Biaryl-verbrücktes Dimer bildet. Beide beobachteten Produkte enthalten die neu geknüpften Bindungen in üblicher ortho Position relativ zur Hydroxygruppe. Diese Ergebnisse wurden durch in vivo 2,4-DCP-Feedingassays mit Ab2 und/oder Ab3-exprimierenden, heterologen E. coli und S. elongatus Stämmen bestätigt.