Protein-Bioengineering der Bacillus sp. MN Chitosanase
Der chemische Pflanzenschutz sichert zwar die vom Verbraucher gewünschte hohe Qualität und den niedrigen Preis durch hohe Ernteerträge (Ernteverlust beim Weizen ohne Pflanzenschutz ˜ 50%, mit Pflanzenschutz ˜ 14% in Deutschland), jedoch stellt er eine große Belastung für Mensch und Ökosystem dar. Es werden häufig große Mengen naturfremder Stoffe auf landwirtschaftlichen Flächen ausgebracht, die schlecht abbaubar und sogar im vom Verbraucher gekauften und verzehrten Produkt noch nachweisbar sind. Aus diesem Grund ist die Etablierung von nachhaltigen Alternativen zum chemischen Pflanzenschutz ein lohnenswertes Ziel. In Indien wird bereits erfolgreich Chitosan als ökologisches nachhaltiges Pflanzenschutzmittel eingesetzt, jedoch fehlt in der Hochertrags-Landwirtschaft hierzulande bislang die Effizienz.
Chitosan ist ein biologisch abbaubarer, ungiftiger Vielfachzucker (Biopolymer), der aus Chitin hergestellt wird. Chitin wird aus einem Industrieabfall der Krabbenindustrie, den Krabbenschalen, gewonnen und besteht aus langen Ketten von verbundenen Zuckereinheiten. Die meisten dieser Einheiten tragen Essigsäure-Gruppen (A), die enzymatisch (durch Biokatalysatoren) oder chemisch an zufälligen Positionen teilweise oder komplett entfernt werden können. Dabei entsteht eine positiv geladene Zuckereinheit (D). Eine Zuckerkette, bei der weniger als 50% der Zuckereinheiten Essigsäure-Gruppen tragen (Anteil von A bei einer Zuckerkette = 50%), wird als Chitosan bezeichnet. Chitin/Chitosan kann mithilfe von biologischen Werkzeugen (Enzymen) in kleinere Zuckerketten (Oligomere) gespalten werden. Zu diesen Enzymen gehören Chitinasen und Chitosanasen, die von vielen Bakterien, Pilzen und Pflanzen gebildet werden. Chitinasen spalten bevorzugt die Bindung zwischen A-A, während Chitosanasen bevorzugt die Bindung zwischen D-D spalten.
Es konnte bereits gezeigt werden, dass kleinere Zuckerketten des Chitosans eine Abwehrreaktion bei Reispflanzen auslösen können. Diese bioaktiven Zuckerketten entstanden bei der Spaltung von langen Chitosan-Zuckerketten mit einer Chitosanase (CSN) aus Bacillus sp. MN. Spaltungsprodukte, welche aus dem gleichen Chitosan mit anderen Enzymen (z.B. Chitinasen) hergestellt wurden, zeigten keine oder eine deutlich schwächere Bioaktivität. Diese Beobachtung legt nahe, dass die Anordnung von den Essigsäure-Gruppen bei den Spaltungsprodukten einen starken Einfluss auf deren bioaktive Wirkung besitzt. In diesem Projekt sollen daher Enzym-Varianten der CSN mit verändertem Spaltungsmuster hergestellt werden, um die Bioaktivität der entstehenden Spaltungsprodukte genauer zu untersuchen und zu optimieren. Dabei soll sich zeigen, ob eine Veränderung der Spaltungsprodukte der CSN eine Veränderung und möglicherweise eine Verbesserung der Bioaktivität bewirkt. CSN besitzt sechs Zuckerbindetaschen (-3 bis +3), welche weitestgehend negativ geladen sind und daher positiv geladenes D eines Chitosans binden. Durch gezielte Veränderungen der Zuckerbindetaschen (z.B. durch eingebrachte positive Ladungen) der CSN sollen hier bevorzugte Bindungen zu A entstehen. Anschließend sollen die Spaltungsprodukte der Enzym-Varianten miteinander bezüglich ihrer Zusammensetzung und Bioaktivität auf Pflanzen verglichen werden.
Parallel soll in einem alternativen Ansatz die vorhandene Biodiversität genutzt werden, um unterschiedliche bioaktive Spaltungsprodukte herzustellen. Drei Chitosanasen aus verschiedenen Organismen sollen laut Literatur unterschiedliche Spaltungspositionen besitzen. Während CSN ausschließlich zwischen D-D zu spalten scheint, spaltet eine Chitosanase aus Streptomyces sp. N174 zwischen D-D und A-D, und weitere aus Bacillus circulans MH-K1 zwischen D-D und D-A. Durch diese unterschiedlichen Spaltungspositionen sollten bei der Spaltung des gleichen Chitosans mit diesen drei Enzymen unterschiedliche Spaltungsprodukte entstehen. Daher sollen diese vergleichend charakterisiert und deren Bioaktivität auf Pflanzen untersucht werden. Dabei soll sich zeigen, ob andere Chitosanasen ebenfalls Spaltungsprodukte mit bioaktiver Wirkung auf Pflanzen aus Chitosan produzieren.
Die Enzyme, die in den vorangegangenen Experimenten effizient bioaktive Spaltungsprodukte aus Chitosan produziert haben, sollen anschließend verwendet werden, um ein mögliches Produktionsverfahren zur kosteneffizienten Herstellung von bioaktiven Zuckern aus Chitin/Chitosan zu erarbeiten. Dadurch soll ein wichtiger Beitrag zur Etablierung eines effektiven und ökologischen Pflanzenschutzes mit Chitosan in Deutschland geleistet werden.