Wasserstoffmetabolismus der Cyanobakterien
Das Cyanobakterium Synechocystis spec. PCC 6803 produziert Photowasserstoff im Licht und fermentativen Wasserstoff im Dunkeln. Im Licht ist die Photowasserstoffproduktion direkt mit dem photosynthetischen Elektronentransport verbunden. In vorangegangenen Arbeiten in unserer Arbeitsgruppe konnten wir zeigen, dass am Photosystem I (PSI) Ferredoxine als direkte Elektronenüberträger zur Hydrogenase fungieren. Dies wurde bisher jedoch nur für die pflanzlichen Ferredoxine mit einem [2Fe-2S]–Cluster gezeigt. In dieser Arbeit lag der Fokus auf zwei bakteriellen Ferredoxinen mit einem [4Fe-4S]–Cluster: Fdx7 (Sll0662) und Fdx9 (Slr2095). Für Fdx7 konnte kein Einfluss auf die Wasserstoffproduktion nachgewiesen werden, im Gegensatz zu Fdx9. Hier zeigten sich Veränderungen in der Wasserstoffproduktion. Die Mutante in der fdx9 ausgeschaltet wurde zeigte eine geringere Photowasserstoffproduktion im Vergleich zum Wildtyp. Der genaue Einfluss muss jedoch weiter untersucht werden.
In dieser Arbeit wurden ebenfalls die Flavoproteine flv2/4 und flv3 deletiert, die eine wichtige Rolle im photosynthetischen Elektronentransport spielen. Es konnte gezeigt werden, dass der Flavoproteindimer Flv2/4 in Konkurrenz mit der Hydrogenase um Elektronen steht und die Photowasserstoffproduktion in flv2/4 im Gegensatz zum Wildtyp und zu flv3 entsprechend erhöht ist.
Fermentativer Wasserstoff wird im Dunkeln auf Kosten des Abbaus von Glykogen bzw. Glukose erzeugt. Bisher waren zwei Glukoseabbauwege in Synechocystis bekannt, der Embden-Meyerhoff-Parnass- (EMP, oder Glykolyse) und der Oxidativer-Penthose-Phoshat- (OPP) Weg. Um untersuchen zu können welcher Weg für die fermentative Wasserstoffproduktion von Bedeutung ist, sollte der zentrale Kohlenstoffmetabolismus genauer analysiert werden. Eine vorangegangene Arbeit unserer Arbeitsgruppe ließ vermuten, dass es neben dem EMP- und OPP-Weg noch einen weiteren, bisher unbekannten Glukoseabbauweg in Synechocystis geben könnte: den Entner-Doudoroff- (ED) Weg. Über Sequenzvergleiche wurden die für den ED-Weg essentiellen Gene, sll0107 als potentielle KDPG-Aldolase (Eda) und slr0452 als potentielle 6-P-Glukonat-Dehydratase (Edd) identifiziert. In dieser Arbeit konnte die potentielle KDPG-Aldolase (Eda) komplett und edd teilweise aus dem Genom von Synechocystis deletiert werden. Beide Mutanten zeigten einen ausgeprägten Phänotyp im Wachstum unter mixotrophen Bedingungen (im Dauerlicht unter Zugabe von Glukose). Die potentielle KDPG-Aldolase aus Synechocystis wurde in Synechocystis überexprimiert und isoliert. Das Enzym setzte KDPG mit einem KM-Wert von 0,095 zu Pyruvat um. Der Wachstumsphänotyp der eda-Mutante, ließ sich durch eine Überexpression der KDPG-Aldolase aus Synechocystis und aus E. coli komplementieren. Zusammengenommen, weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass der Enter-Doudoroff-Weg in Synechocystis abläuft und hier als Glukoseabbauweg lange übersehen wurde.
Datenbankrecherchen unserer Arbeitsgruppe hatten ergeben, dass potentielle Gene für das Schlüsselenzym des ED-Weges (die KDPG-Aldolase) und edd auch in Pflanzengenomen weit verbreitet sind. Aus diesem Grund wurde die potentielle KDPG-Aldolase aus Gerste (Hordeum vulgare) in E. coli überexprimiert und isoliert. Sie setzte KDPG mit einem KM-Wert von 0,35 zu Pyruvat um. Gerste verfügt damit wie Synechocystis über eine funktionelle KDPG -Aldolase.
Erste Wasserstoffmessungen mit verschiedenen Mutanten, in denen entweder der ED-, der EMP- oder der OPP-Weg unterbrochen war, zeigte, dass insbesondere der OPP-Weg eine Rolle für die fermentative Wasserstoffproduktion spielen könnte. Da diese Mutante unter den gegebenen Bedingungen nicht gut wuchs, kann die verminderte fermentative Wasserstoffproduktion jedoch auch eine indirekte Folge auf das Ausschalten des OPP-Weges sein. In einem Experiment zeigte die Mutante mit deletiertem ED-Weg eine stark gesteigerte fermentative Wasserstoffproduktion.