Projekt 34295/01

Nachweis von Tropenholz in Papier – Chemotaxonomie und Anatomie zur Identifizierung von Mixed Tropical Hardwood

Projektdurchführung

Universität Hamburg Fachbereich Biologie Institut für Holzwissenschaften Abteilung Chemische Holztechnologie
Haidkrugsweg 1
22885 Barsbüttel

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Die Bedeutung von Wäldern generell und von Tropenwäldern im Speziellen ist von hoher Umweltrelevanz. Die Entwaldung wird als größte Quelle anthropogener CO2-Emissionen gesehen. Zwei Drittel der an die Erdoberfläche gebundenen Biodiversität wird den Tropenwaldökosystemen zugerechnet.
Eine zentrale Rolle bei der Entwaldung wird dem illegalen Holzeinschlag zugeschrieben. Eine wichtige Reaktion ist das Verbot der Vermarktung von illegal gewonnenem Holz durch nationale und internationale Behörden. Die EU-Kommission hat deshalb 2003 einen Aktionsplan mit der Bezeichnung „Forest Law Enforcement, Governance and Trade“ (FLEGT) aufgelegt, der über EU-Verordnungen im Rahmen der EUTR (Europäische Holzhandelsverordnung) sowie das deutsche Holzhandelssicherungsgesetz in eu-ropäisches und nationales Recht umgesetzt wird.
Eine wichtige, zu kontrollierende Produktgruppe ist Papier. Die Bedeutung ergibt sich aus den extrem hohen Produktionsmengen und der Tatsache, dass es sich bei Papieren um Produkte aus „komplexen Lieferketten“ handelt. Die Ermittlung der für die Papierherstellung verwendeten Holzarten ist heute nur durch vergleichende Fasermikroskopie mit Hilfe von Referenzfasern möglich. Viele tropische Holzarten können mangels Referenzmaterialien oder mangels spezifischer Merkmale bisher nicht eindeutig identifiziert werden. Eine eindeutige Identifizierung der Fasern erfordert daher die Bereitstellung von belegtem Referenzmaterial und die Bestimmung geeigneter Identifizierungsmerkmale. Dieses fehlt für viele mixed-tropical-hardwood-Arten (MTH-Arten). Verschärft wird die Situation in Zukunft durch die verstärkte Nut-zung der sogenannten „lesser known species“, wodurch sich die Artenvielfalt in Zellstoff und Papier wei-ter erhöhen wird.
Aus diesem Grund war und bleibt es wichtig, die vorhandenen Datenbanken aufzustocken und weitere Holzarten der „lesser known species“ sowohl in den morphologischen Gefäßatlas als auch in die Extraktstoffdatenbanken für die chemische Identifizierung aufzunehmen.
Das Ziel des Projekts im Bereich Anatomie war es deshalb, für mindestens 20 weitere Gattungen die anatomischen Referenzen zu erstellen und in einer zweiten Auflage des Gefäßatlasses zu veröffentlichen.
Diese Arbeit war notwendig, um eine erweiterte und damit immer engmaschigere Überprüfung der EUTR
zu ermöglichen. Sie liefert gleichzeitig die Erkenntnis, für welche Arten die Lichtmikroskopie nicht aus-reicht und für welche Arten eine von der Anatomie unabhängige Methode zum eindeutigen Nachweis erforderlich ist.
Um diese Lücke zu schließen initiierte PD Dr. Jürgen Odermatt († 30. Mai 2019) dieses Projekt mit dem Schwerpunkt Chemotaxonomie. Auf Basis des schon im Vorgängerprojekt gefassten chemotaxonomi-schen Ansatzes zur Identifizierung von MTH in Papier war es das Ziel dieses Projekts diese Methode zu einer gerichtsfesten Methode zu entwickeln. Die bisher schwerpunktmäßig untersuchte 1D-GC Variante TD-GC/MS sollte erweitert / verbessert werden.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenUm die Projektziele zu erreichen, wurden acht Arbeitspakete definiert.

AP 1. Auswahl relevanter neuer Gattungen
Aus Herstellerangaben zu den dem Thünen-Kompetenzzentrum Holzherkünfte zugesandten Papierproben und in Zusammenarbeit mit den Kooperationspartnern und Projektbegleitern wurden 21 in der Papierindustrie relevante Hölzer ermittelt, für die neue Referenzen erstellt wurden.

AP 2. Materialbeschaffung und Herstellung von Referenzproben (Mazerate und Zellstoffe)
Für den Aufbau der anatomischen Referenzen wurden für die neu ausgewählten Hölzer Mazerate aus kleinen Teilstücken der wissenschaftlichen Xylothek des Thünen-Instituts für Holzforschung erstellt. Aus-reichend Material zur Herstellung sortenreiner Zellstoffe für die chemotaxonomischen Untersuchungen konnte für sechs Hölzer, plus drei weite Provenienzen der Art Tectona grandis beschafft werden. Davon wurden alle aufgeschlossen und zu vollgebleichten Zellstoffen weiterverarbeitet. Die Zellstoffe wurden gemahlen, extrahiert, konzentriert und mittels TD-GC/MS analysiert.

AP 3. Anatomie: Aufbau der Referenzen und Veröffentlichung
Für alle Gattungen wurden die Gefäßelemente aus den Mazeratproben herauspräpariert und eingebettet. Die Dauerpräparate der Gefäßelemente wurden bildlich dokumentiert und wissenschaftlich ausgewertet. Eine Veröffentlichung in Form eines zweiten Bandes des Gefäßatlas ist geplant.

AP 4. Chemotaxonomie: Optimierung der Extraktion, der Fraktionierung und der Messbedingungen
Vor der Optimierung der Extraktion stand die Wahl einer geeigneten Mühle für die Zellstoffvorbereitung. Es wurden verschiedene Mühlen verglichen und eine Wahl unter neuen Gesichtspunkten getroffen. Die Kryomühle der Firma Retsch wurde gewählt.
Die sukzessive Extraktion wurde anhand eines MTH-Industriezellstoffs im Hinblick auf Probenmenge, Lösungsmittelwahl, Extraktionszeit und Anzahl der Extraktionszyklen optimiert.
Während des Optimierungsprozesses konnten Verunreinigungen und weitere potentielle Fehlerquellen identifiziert und durch das Etablieren einer Laborroutine weitestgehend ausgeschlossen werden. Verbessert wurden unter anderem die Lösungsmittelreinheit und die Sauberkeit der Extraktionshülsen und der zum Abdecken der Probe verwendeten Watte.
Die systematische Untersuchung der Vorfraktionierung mittels Solid-phase Extraktion (SPE) als ein Schwerpunkt des Projektes wurde in einer Masterarbeit erfolgreich geschrieben. Auf Basis der dort ge-wonnenen Erkenntnisse lief eine weiterführende Bachelorarbeit zu dem Thema. Ziel war es, eine valide Extraktaufbereitung mittels SPE zur Verbesserung der Auflösung der eindimensionalen GC zu etablieren und damit einen Informationsgewinn zu erzielen. Zudem wurde die Reproduzierbarkeit der SPE-Ergebnisse untersucht.

AP 5. Quantifizierung ausgewählter Holzarten
Es wurden Kalibrierextrakte (Extrakte von Zellstoffmischungen mit definierten Anteilen von MTH- und Raminzellstoff) hergestellt und untersucht. Es wurden Kalibrierproben mit 0-1-2-5-10-25-50-75-100% Ramin hergestellt, wobei es sich bei 0% und 100% um die beiden Referenzen Ramin- und MTH-Zellstoff handelt (0% Ramin entspricht 100% MTH-Zellstoff). Zur Ermittlung der spezifischen Ramin-Marker (Io-nen) wurde ein Abgleich der GC/MS-Datensätze durchgeführt. Die Ausgangsliste wurde auf 370 Marker begrenzt. Für Analysen der oberen Kalibrierextrakte im SIM-Modus wurden daraus 115 Ionen für die Er-stellung der SIM-Methode selektiert. Diese Analysen wurden verwendet, um weitere Ionen, bei denen keinerlei Korrelation zwischen Raminanteil und Peakfläche hergestellt werden konnte, auszusortieren, um die SIM-Methode zu optimieren. Es wurden mehrere Markerionen gefunden, die teilweise einen linearen Verlauf und ein Bestimmtheitsmaß von >80 Prozent aufwiesen, wobei die Kalibrierprobe mit 75% Raminanteil leider Ausreißer enthielt.

AP 6. Datenauswertung für chemotaxonomische Untersuchungen
Der bestehende Datenbankansatz konnte durch eine geeignete Vorbehandlung der Daten verbessert werden. In Kooperation mit den Softareentwicklern konnten neue hilfreiche Funktionen implementiert
werden, die die Auswertung mittels „ChromIdent“-Datenbank deutlich verbesserte. Es wurde eine umfassende Datenbank mit Chromatographiedaten von 38 Zellstoffextrakten aufgebaut.

AP 7. Blindtest
Die im Projekt erworbenen Erkenntnisse zur Chemotaxonomie und Fasermorphologie von MTH-Zellstoffen wurden von den beteiligten Projektpartnern an Blindproben angewendet.

AP 8. Berichterstellung (Zwischen- und Abschlussbericht)
Der Verlauf des Projektes und die gewonnenen Erkenntnisse wurden in dem Zwischenbericht zur Halbzeit des Projektes (nach einem Jahr) und nach Ablauf des Projektes dem Projektförderer dargelegt.


Ergebnisse und Diskussion

21 neue, relevante Gattungen wurden für die Untersuchungen ausgewählt. Die Materialbeschaffung, Mazeration und die Präparation der Gefäßelemente für die anatomischen Untersuchungen sind abgeschlossen. An den Mazeraten wurden Faserlänge und Faserwanddicke im Fiberlab® analysiert. Bildtafeln für 20 Laubhölzer und die Beschreibungen der morphologischen Merkmale (z.B. Form der Ge-fäßelemente und der Fortsätze, Anordnung der Tüpfel und Art der Gefäßdurchbrechungen) für 10 Hölzer wurden fertiggestellt. Nach dem Vorbild des schon veröffentlichten Gefäßatlas (Helmling et al., 2018) soll jede Gattung mit jeweils einer Textbeschreibung mit einer Tabelle der Messwerte und einer Bildtafel als Referenz durch die Veröffentlichung im IAWA-Journal weltweit allen Prüfinstituten zur Verfügung gestellt werden.
Für die chemotaxonomischen Untersuchungen konnten von sechs verschiedenen Hölzern, plus drei Plantagenhölzern unterschiedlicher Herkünfte zu einer Art, ausreichend Material beschafft und daraus sortenreine Zellstoffe hergestellt werden.
Die sukzessive Extraktion wurde anhand eines MTH-Industriezellstoffs im Hinblick auf Probenmenge, Lösungsmittelwahl, Extraktionszeit und Anzahl der Extraktionszyklen optimiert. Während des Optimie-rungsprozesses konnten Quellen für Verunreinigungen und weitere potenzielle Fehlerquellen identifiziert werden. Durch das Etablieren einer Laborroutine können diese Fehlerquellen für zukünftige Arbeiten weitestgehend ausgeschlossen werden. Diese Maßnahmen führten zu einer verbesserten Qualität der Zellstoffextrakte mit einer deutlichen Verringerung von Verunreinigungen.
Daher wurden von allen Zellstoffen, die für die Datenbank und den Blindtest vorgesehen waren, neue Extrakte hergestellt und gaschromatographisch analysiert.
Mit diesen Messdaten der Hexanextrakte wurde mit der sich stetig weiterentwickelnden Datenbanksoftware „OpenChrom“ erstmals eine Datenbank aufgebaut.
Die systematische Untersuchung der Vorfraktionierung mittels Festphasenextraktion (SPE) als ein Schwerpunkt des Projektes lieferte in einer Masterarbeit wichtige Erkenntnisse und Lösungsansätze zur Verbesserung der Fraktionierung. In einer weiterführenden Bachelorarbeit zur Optimierung der SPE wurden die Einflussgrößen auf die Trennschärfe und Fraktionierung weiter untersucht. Weitere Untersu-chungen zur Reproduzierbarkeit folgten, um eine valide Extraktaufbereitung mittels SPE zur Verbesse-rung der Auflösung der eindimensionalen GC etablieren und damit einen Informationsgewinn erzielen zu können. Es zeigte sich, dass sich diese Methode für den Informationsgewinn eignet, die Fragestellungen in diesem Projekt jedoch höhere Ansprüche an die Reproduzierbarkeit haben.
Die Untersuchungen zur Derivatisierung brachten im Bereich der SPE und der Acetonextrakte wichtige Hinweise auf den Informationsgewinn durch die Anwendung dieser Methodik.
Bei der Entwicklung einer Quantifizierungsmethode von Gonystylus spp. (Ramin) wurden weitere Erkenntnisse hinzugewonnen.
Abgeschlossen wurde das Projekt mit einem Blindversuch. Der Hochschule München wurden die vorliegenden 38 Referenzzellstoffe zu Verfügung gestellt mit der Aufgabe, 15 Prüfblätter unbekannter Zu-sammensetzungen herzustellen. Die Zusammensetzungen wurden vom Thünen-Institut, der TU Darmstadt und der ISEGA mittels Mikroskopie auf Basis des Gefäßatlasses ermittelt. Erstmals kam auch die neu aufgebaute Extraktstoff-Datenbank für eine umfassende chemotaxonomische Bestimmung zum Einsatz. Im Rahmen des Blindtests waren 38x15=570 Entscheidungen zu treffen. Es wurde von den drei In-stituten mit der anatomischen Methode eine hervorragende Trefferquote von 95%, 84% und 98% erreicht. Das beste Ergebnis wurde dabei von der ISEGA erzielt, die an der Erstellung der Referenzen nicht beteiligt war und ausschließlich mit den fertigen Referenzen gearbeitet hat. Dies beweist, dass die im Projekt erstellten Referenzen bestens für die Identifizierung von diesen Hölzern in Papier geeignet sind.
Mit dem chemotaxonomischen Ansatz wurde an der UHH im ersten Anlauf eine Trefferquote von 86% erzielt. Der Blindtest zeigte zudem, dass es Hölzer gibt, die mit beiden Methoden sicher erkannt werden und Hölzer, die mittels Anatomie oder Chemotaxonomie sicherer erkannt werden. Dies verdeutlicht, dass die beiden Methoden sich, wie im Projektantrag prognostiziert, gegenseitig untermauern und ergänzen können.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Veröffentlichungen:
• Helmling S (2020) Identification of Mixed Tropical Hardwood (MTH) by characteristic morphological features - a contribution to species protection. Hamburg: Univ Hamburg, Fakultät für Mathematik, In-formatik und Naturwissenschaften, 243 p, Hamburg, Univ, Fak f Mathematik, Informatik und Natur-wissenschaften, Fachber Biologie, Diss
• Fabio Hubel (2020) Metrische Erfassung der Gefäßelement- und Gefäßtüpfelgrößen von 14 asiati-schen Holzarten an mazerierten Gefäßen im Vergleich zu den an Schnitten erhobenen Literaturda-ten. Bachelorarbeit, Universität Hamburg
• Schmitz N, Beeckman H, Blanc-Jolivet C, Boeschoten L, Braga JWB, Cabezas JA, Chaix G, Crameri S, Degen B, Deklerck V, Dormontt EE, Espinoza E, Gasson P, Haag V, Helmling S, Horacek M, Koch G, Lancaster C, Lens F, Lowe A, Martìnez-Jarquin S, Nowakowska JA, Olbrich A, Paredes-Villanueva KP, Pastore TCM, Ramananantoandro T, Razafimahatratra AR, Ravindran P, Rees G, Soares LF, Tysklind N, Vlam M, Watkinson Ch, Weeler E, Winkler R, Wiedenhoeft AC, Zemke VTh, Zuidema P (2020) Overview of current practices in data analysis for wood identification : A guide for the different timber tracking methods. GTTN secretariat, European Forest Institute and Thünen Insti-tute, 141 p, DOI:10.13140/RG.2.2.21518.79689
• Reck, H., (2019): Prüfung und Entwicklung einer Methode zur Fraktionierung lipophiler Substanzen mittels Festphasenextraktion. Bachelorarbeit. Universität Hamburg, Hamburg
• Hahn, L., (2018): Fraktionierung von Holzextrakten mittels Festphasenextraktion zur Verbesserung der Auflösung chromatographischer Verfahren. Masterarbeit. Universität Hamburg, Hamburg.
• Helmling S, Olbrich A, Heinz I, Koch G (2018): Atlas of vessel elements – identification of Asian tim-bers. IAWA Journal 39 (3)
• Leif Junge (2018) Referenzen für die Faseranalytik. Bachelorarbeit, Universität Hamburg
Vorträge:
• Haag V, Olbrich A, Koch G, Heinz I, Helmling S, Sieburg-Rockel J (2020) Thünen Centre of Compe-tence on the Origin of Timber - Identification of internationally traded timber. GTTN Future Webinar
• Olbrich A, Helmling S, Heinz I, Sieburg-Rockel J, Koch G (2019): Identification of Asian timbers in pulp, paper and fiber boards. XXV IUFRO Congress, Curitiba, Brazil (Vortrag im Oktober 2019)
• Helmling S (2019): Identifizierung asiatischer Hölzer in Papier. ZELLCHEMING-Expo, Frankfurt a. M.
• Olbrich A, Helmling S, Heinz I, Sieburg-Rockel J, Koch G (2019): Identification of Asian timbers in pulp, paper and fiber boards. IAWA-IUFRO International Symposium: Challenges and Op-portunities for Updating Wood Identification Beijing, China
• Sieburg-Rockel J, Olbrich A, Helmling S (2018): Holzartenbestimmung an Spanplatten und Papier und topochemische Untersuchungen (UMSP) zur Qualitätsbeurteilung von Spanplatten. 4. Hol-zanatomisches Kolloquium, Dresden
• Schmitz N, Olbrich A (2018): Evaluating the potential to develop a vessel atlas for Latin America. GTTN Regional Workshop Latin America, Lima, Peru
• Olbrich A (2018): Paper forensics and legality verification. TREE meeting, Hamburg
• Olbrich A, Sieburg-Rockel J (2018): Identifizierung weniger bekannter Holzarten in Papier und Spanplatten. Forstwissenschaftliche Tagung 2018, Göttingen


Fazit

Im vorliegenden Projekt wurden zwei verschiedene Ansätze zur Identifizierung von MTHs in Papier verfolgt, die Chemotaxonomie und die Anatomie.
Für die Anatomie wurden 21 Referenzen erstellt, die vollständig analysiert und vermessen worden sind. Für eine Veröffentlichung liegen für 20 Laubhölzer Bildtafeln und für 10 Hölzer die Beschreibungen vor. Genau wie die Veröffentlichung der 38 Taxa der Vorgängerprojekte, sollen auch diese Referenzen im IAWA-Journal allen internationalen Prüfinstituten zur Verfügung gestellt werden.
Durch den Blindtest konnte zudem gezeigt werden, dass die Methode etabliert ist und die in den Projekten erstellten Referenzen geeignet sind, die Hölzer gut bis sehr gut in Papier nachzuweisen.
Die Chemotaxonomie konnte in diesem Projekt für die Identifizierung von Hölzern in Papier maßgeblich weiterentwickelt werden. Die Methode der Extraktion ist etabliert und mit den Chromatogrammen eine Datenbank aufgebaut. Eine Veröffentlichung der Methodik und der Ergebnisse ist geplant. Erstmals wurde diese Technik im Blindtest getestet. Auch wenn die Software zum Abgleich der Blindproben mit der Datenbank weiter verbessert werden sollte, konnten sechs Hölzer bereits zu 100% richtig bestimmt werden und eine Gesamtquote der Blindtestauswertung von 86 % richtigen Entscheidungen erreicht werden.