Projekt 25448/01

Entwicklung von ionischen Flüssigkeiten höherer Eigensicherheit unter Verwendung einer flexiblen (öko-)toxikologischen Testbatterie

Projektdurchführung

Universität Bremen Zentrum für Umweltforschung und nachhaltige Technologien - UFT
Leobener Str. 6
28359 Bremen

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Ein zentrales Element der Forderung nach einer nachhaltigen Chemie ist die Entwicklung von Chemikalien mit hoher Eigensicherheit, d.h. Substanzen, in denen schon bei der Syntheseplanung bewusst auf toxikologisch und ökotoxikologisch problematische Strukturelemente verzichtet wird. Ionische Flüssigkeiten stellen in diesem Zusammenhang eine Substanzklasse mit einem vielversprechenden Potenzial für die unterschiedlichsten technologischen Anwendungen dar. Aufgrund der Strukturvielfalt innerhalb dieser Substanzklasse lassen sich gezielt Verbindungen für eine technologische Anwendung designen. Diesem technologischen Vorteil steht jedoch diametral die Problematik der toxikologischen und ökotoxikologischen Bewertung einer solch unüberschaubar großen und dazu noch sehr heterogenen Substanzklasse gegenüber, die nur überwunden werden kann, wenn parallel zu der Optimierung der technologischen Eigenschaften vor allem auch eine Optimierung hin zu einem geringen Gefahrenpotenzial einer Ionischen Flüssigkeit stattfindet.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenFür die Zukunft wird eine noch viel breitere Verwendung Ionischer Flüssigkeiten in unterschiedlichsten Verbraucherprodukten erwartet, so dass die bereits heute bestehende Exposition von Mensch und Umwelt gegenüber diesen Substanzen deutlich ansteigen kann. Gemessen daran ist das vorhandene Wissen zur Toxikologie und Ökotoxikologie von Ionischen Flüssigkeiten sehr begrenzt. Das Hauptziel dieses Projektes ist es daher, in einer Pilotstudie aufzuzeigen, wie man in enger Kooperation mit Industriepartnern mit Hilfe einer systematischen und integrierten Teststrategie - also einer wie unter der neuen EU Chemikalienverordnung geforderten anwendungsorientierten Teststrategie - und einer flexiblen toxikologischen/ökotoxikologischen Testbatterie zu einem nachhaltigen Design von Ionischen Flüssigkeiten mit einem reduzierten Gefahrenpotenzial für Mensch und Umwelt kommen kann. Am Ende des Projektes soll dann ein Geschäftsmodell stehen, das die Testbatterie und das zu entwickelnde internetbasierte Software-Tool Entwicklern und Anwendern von Ionischen Flüssigkeiten angeboten werden soll, um von Beginn an gezielt Strukturelemente mit einem geringen Gefahrenpotenzial für ihre Prozesse oder Produkte auszuwählen.
Folgende Projektziele sollen dazu in einem Zeitraum von 24 Monaten umgesetzt werden:

Anwendungsorientierte Erweiterung der bereits am UFT bestehenden Testbatterie um:
a.) wirkmechanismenbasierte Testsysteme und
b.) weitere Screnning-Tests zur Erfassung von toxikologisch besonders relevanten Endpunkten.

Optimierung bestehender Testsysteme, um zukünftig das Screening großer Substanzdatenbanken (hin-sichtlich der REACH-Fragestellungen) zu ermöglichen.

Testung von ausgewählten, durch die Kooperationspartner aus der Industrie (Merck, IoLiTec und Merck Solvent Innovation) vorgeschlagenen und entwickelten Ionischen Flüssigkeiten in der erweiterten und optimierten Testbatterie.

Parallele Optimierung bestehender und Etablierung neuer theoretischer Vorhersagemodelle (SAR- und QSAR-Modelle) für die jeweiligen Testsysteme zur prospektiven Abschätzung von Gefahrenpotenzialen von Ionischen Flüssigkeiten und für ionische Verbindungen generell auf Basis der generierten Daten

Entwicklung eines internetbasierten Softeware-Tools für die Produzenten Ionischer Flüssigkeiten, mit der die Toxizitäten neuer Verbindungen für die einzelnen Testsysteme der Testbatterie über QSAR-Algorithmen abgeschätzt werden kann.


Ergebnisse und Diskussion

Die drei wichtigsten Ziele dieses Projektes waren zum einen die Optimierung bestehender Testsysteme einer flexiblen Testbatterie hin zu miniaturisierten in vitro Screening-Systemen, mit denen sich bei minimiertem Zeit-, Arbeits- und Materialaufwand große Mengen an Ionischen Flüssigkeiten und prinzipiell beliebig weiterer Chemikalien testen lassen. Zum zweiten sollte im Rahmen dieses Projektes die Testbatterie, in Zusammenarbeit mit der Ionovation GmbH, um neue Testsysteme erweitert werden. Dabei stand hier vor allem die detaillierte Aufklärung möglicher Wirkmechanismen von ILs im Vordergrund. Aufbauend auf vorhandenen toxikologischen Daten und der daraus folgenden Interpretation, dass viele ILs primär mit biologischen Membranen interagieren, sollte hier vor allem die Wechselwirkung von ILs mit Lipid-Doppelschichten mit weiteren zellfreien Methoden untersucht werden. Zusätzlich sollten neue Testsys-teme in die Testbatterie integriert werden, die ein Screening auf mögliche besonders besorgniserregende Eigenschaften wie östrogene Wirksamkeit, genotoxische Effekte und das chemosensitivierende Po-tenzial von ILs liefern können.
Das dritte Ziel dieses Projektes war die Zusammenstellung der verfügbaren Daten und die Implementierung von Vorhersagealgorithmen zur prospektiven Gefahrenpotenzialanalyse von verschiedenen Kombi-nationen aus Kationen und Anionen von ILs. Dazu sollte ein datenbankbasiertes Internet Software-Tool entwickelt werden, dass Produzenten und Anwendern von ILs zur Verfügung gestellt werden soll.
Es wurde zunächst die bestehende Analytik erfolgreich optimiert, so dass jetzt die Analytik von Kationen und Anionen von ILs in verschiedenen Matrizes möglich ist. Besonders erweitert werden konnte die Ana-lytik durch ionenchromatographische Methoden, die jetzt in Kombination mit Leitfähigkeitsdetektoren auch einen zuverlässigen und sensitiven Nachweis von nichtaromatischen Kationen und vor allem von allen gängigen Anionen von ILs ermöglicht. Ebenfalls erfolgreich optimiert werden konnten die aquatischen Testsysteme mit der limnischen Grünalge Scenedesmus vacuolatus und der Wasserlinse Lemna minor. Für den Test mit der Wasserlinse ist es gelungen die Volumina und Bedingungen so zu optimieren, dass der Test jetzt in 6-Loch-Zellkulturplatten im 10mL Maßstab durchgeführt werden kann. Dies er-laubt bei gleichzeitiger Erhöhung der getesteten Konzentrationsstufen pro Zeiteinheit einen höheren Durchsatz an Substanzen und Replikaten. Dies erhöht die Effizienz und die statistische Sicherheit des Testes. Für die Algen ist es gelungen, den Ansatz ebenfalls auf 6-Loch-Zellkulturplatten zu übertragen, zum anderen konnte in Kooperation mit der Universität Göteborg ein alternatives Testdesign etabliert werden, dass den gesamten Arbeits- und Zeitaufwand um ca. 50% reduziert. Beide neuen Testansätze mit den Algen erlauben daher ein effizienteres Screenen von Substanzen. Die Validität der neue etablierten Testprotokolle für die Tests mit der Wasserlinse und mit der Grünalge wurde sowohl mit literaturbekannten Referenzsubstanzen, als auch mit ILs, für die nach den alten Protokollen schon Daten erhoben wurden, verifiziert. Die Abweichungen für beide Testorganismen zu den alten Protokollen liegen hier unter 10%, was für biologische Testsysteme ein ausgezeichneter Wert ist.
Bei den neu hinzugekommenen Testsystemen haben sich vor allem die elektrophysiologischen und fluoreszenzbasierten Untersuchungen der Ionovation GmbH als sehr erfolgreich dargestellt. Mit diesen Methoden konnten erstmals verschiedene Mechanismen der Interaktion von IL Kationen und Anionen mit biologischen Membranen sichtbar gemacht werden und es konnten für die unterschiedlichen Interaktionen so spezifische Struktur-Wirkungsbeziehungen für ILs abgeleitet werden. Des Weiteren konnten mit dem E-Screen Assay, dem Umu-Test und dem Test auf chemosensitivierende Wirkung von ILs drei wichtige in vitro Testsysteme erfolgreich in die Testbatterie integriert werden, die es erlauben über die rein membranvermittelte Wirkung von ILs hinaus, weiter spezifische Endpunkte zu screenen. Besonders die Endpunkte zur östrogenen Wirksamkeit und zur Genotoxizität haben dabei hohe Aktualität für die Chemikaliengestzgebung unter REACh. Die ersten Testkits, die mit diesen neuen Testsystemen untersucht wurden deuten an, dass für die ILs im Allgemeinen großer Forschungsbedarf auf diesen Gebieten besteht. Zu den genannten Testsystemen konnten weiterhin der Arthrobacter-Test, der somit auch das Kompartiment Boden für das Screening von ILs zugänglich macht, und verschiedene Enzymhemmtests und subzelluläre Endpunkte (oxidativer Stress) als spezifische Targets in die Testbatterie integriert werden. Nicht erfolgreich integriert werden konnten dagegen die geplanten Pflanzenzellkulturen. Hier erwiesen sich die nötigen Kulturbedingungen und das Handling als zu komplex, um ein robustes Screening-Testprotokoll zu entwickeln. Gedacht waren diese Pflanzenzellkulturen als Testsysteme zur Priorisierung von ILs für aufwändigere Pflanzenwachstumstests an z. B. Kresse oder Weizen. Alternativ wurde nun ein Test an dem Wasserfloh Daphnia magna mit aufgenommen, da dieser Test unmittelbar für REACh relevant ist.
Um das hier generierte Wissen zu ILs höherer Eigensicherheit auch unmittelbar den Produzenten und Anwendern von ILs zur Verfügung stellen zu können, ist ein datenbankgestütztes Tool nötig. Dieses soll zum einen die generierten Datensätze nach dem Baukastenprinzip in einem einheitlichen Format speichern und anschließend über verschiedene Vorhersagealgorithmen toxikologisch relevante Eigenschaften von neuen Kombinationen von Kationen und Anionen abschätzbar machen. Dazu wurden, aufbauend auf der bereits existierenden IL-Datenbank am UFT, von der CHEOPS GmbH in diesem Projekt zunächst Eingabetools für eine SQL-Datenbank für die neu etablierten Testsysteme entwickelt. Diese konnten erfolgreich in die Datenbankstruktur integriert werden und erlauben nun auch für weitere Testsysteme die automatische Generierung von Dosis-Wirkungskurven und die Berechnung toxikologisch relevanter Daten wie EC50 Werte aus diesen Rohdaten. Da sich wie oben diskutiert die Hydrophobie der bisher getes-teten ILs als ein wesentlicher Parameter bei der Beschreibung der beobachteten toxischen Effekte herausgestellt hat, wurde dann ein Vorhersage-Tool zur Abschätzung der akuten Zytotoxizität beliebiger Kationen-Anionen Kombinationen aus der Datenbank basierend auf Hydrophobieparametern entwickelt. Dieses Tool konnte von der Cheops GmbH erfolgreich in die Datenbank integriert werden es wird nach der wissenschaftlichen Publikation der zugrundeliegenden Daten für alle Nutzer öffentlich freigeschaltet. Besonders erwähnenswert ist hier noch die erfolgreiche Kooperation mit der Universität Freiburg und dem UFT, wo in einem anderen von der DBU geförderten Projekt diese Vorhersagemöglichkeiten gerade um quantenchemische Berechnungen erweitert werden. Die aktuellen Arbeiten zeigen dabei bereits eine sehr gute Übereinstimmung von Theorie und Experiment, so dass es in naher Zukunft möglich sein wird, auch für noch völlig unbekannte IL Strukturen deren Gefahrenpotenzial vorherzusagen.
Um ein solches Tool in Kombination mit der Testbatterie in Zukunft auch als Dienstleistung für Chemikalienproduzenten anbieten zu können, haben sich die Koordinatoren des Projektes in dem Bremer Programm zur Förderung von Unternehmensgründungen durch Hochschulabsolventen/-innen, Young Professionals - "BRUT" im Rahmen dieses Projektes weiterqualifiziert, um die Chancen und Risiken einer Unternehmensausgründung detailliert zu bewerten. So kann nun zu Projektende ein vollständig ausgearbeiteter Businessplan vorgelegt werden, der neben einer Kostenkalkulation auch eine umfangreiche Marktanalyse beinhaltet. Aufgrund dieser Marktanalyse wurde beschlossen, die Ausgründung vorerst zu verschieben, bis auf regulatorischer Ebene mehr Sicherheit für die Unternehmen über die Nutzbarkeit der durch die Testbatterie erhobenen Daten gewährleistet ist. Sollte dieses Investitionshemmnis abgebaut sein sehen die Projektpartner hier großes Potenzial für die Markteinführung der oben skizzierten Dienstleistung. Die Eckdaten und Überlegungen dafür liegen mit dem hier angehängten Businessplan dann bereits vor und können schnell umgesetzt werden.



Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Im Rahmen des Projektes wurden folgende Publikationen und Fachvorträge erarbeitet:
Stolte, S. (2010) Fachvortrag: Entwicklung von nachhaltigen Chemikalien - Testung und Bewertung der Umweltgefährlichkeit. AG Prof.Thomas Straßner TU Dresden. Organisch-Chemisches Kolloquim
Stolte, S. (2009) Fachvortrag: (Eco)toxicity and biodegradation of ionic liquids - progress in designing inherently safer chemicals. BATIL-2 (Biodegradability and Toxicity of Ionic Liquids) Konferenz, Frankfurt
Stolte, S., Steudte, S., Igartua, A., and Stepnowski, P. (2010) Biodegradation of ionic liquids - a view from a chemical structure perspective. Current Organic Chemistry, accepted for publication.
Arning J. and Matzke M. (2010) Toxicity of ionic liquids towards mammalian cell lines. Current Organic Chemistry, Special Issue Ionic liquids: analytical and environmental issues, review, accepted for publication.
Chul-Woong Cho, Ulrich Preiss, Christian Jungnickel, Stefan Stolte, Jürgen Arning, Johannes Ranke, Andreas Klamt, Ingo Krossing, Jörg Thöming. Ionic Liquids: Predictions of physicochemical properties with experimental and/or DFT calculated LFER parameters to understand molecular interactions in solution. Accepted for publication in The Journal of Physical Chemistry


Fazit

Abschließend lässt sich feststellen, dass die drei wesentlichen Projektziele in der Laufzeit des Vorhabens erreicht werden konnten. Besonders hervorheben möchten die Autoren an dieser Stelle die sehr gute Kooperation von Unternehmen und akademischer Forschung. Nur durch diese enge Verzahnung konnte hier zielgerichtet und effizient an den wesentlichen Punkten gearbeitet werden, von der Auswahl relevanter Leitstrukturen bis hin zu der technischen Umsetzung. Dies zeigt sich auch an gemeinsamen Publikationen, von denen eine bereits erschienen ist und weitere in Planung und Bearbeitung sind. So stehen zum Ende dieses Projektes eine optimierte und um wesentliche Endpunkte erweiterte Testbatterie und ein erstes datenbankgestütztes Vorhersage-Tool zur Verfügung. Die damit in diesem Projekt generierten Daten sind richtungsweisend für die weitere nötige Forschung hin zu eigensicheren und somit nachhaltigeren Ionischen Flüssigkeiten.