Projekt 18965/01

Bacillus thuringiensis subspezies israelensis und entomopathogene Nematoden zur biologischen Bekämpfung des Grünlandschädlings Tipula paludosa

Projektdurchführung

e-nema Gesellschaft für Biotechnologie und biologischen Pflanzenschutz mbH
Klausdorfer Str. 28 - 36
24223 Schwentinental

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Projektziel war die Entwicklung eines kostengünstigen und nachhaltigen biologischen Verfahrens zur Bekämpfung der Larven der Wiesenschnake Tipula paludosa mit dem insektenpathogenen Bakterium Bacillus thuringiensis subspezies israelensis (Bti) und/oder insektenpathogenen Nematoden (EPN). Weiteres Ziel war die Entwicklung von verbesserten Produktions- und Ernteverfahren für Bti und die Entwick-lung einer Qualitätskontrolle auf Basis von monoklonalen Antikörpern für die Quantifizierung der wirksa-men Toxine des Bti-Produkts.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Projektarbeit war in 9 Pakete gegliedert, in denen die drei Partner e-nema GmbH, die Christian-Albrechts-Universität Kiel (CAU) und die ICYBAC GmbH zusammengearbeitet haben. Aus mehreren Isolaten wurden geeignete EPN- und Bti-Stämme für die Bekämpfung von Tipuliden anhand von Labortests ausgewählt. Die Wirkungsmechanismen der Bti Toxine (Cry4A, Cry4B, Cry11Aa und Cyt1Aa) an Tipuliden wurden untersucht. Zur Optimierung des Produktionsmediums für Bti wurde eine Selektion mittels genetischer Algorithmen durchgeführt. Verschiedene Verfahren zur Ernte von Bti wurden getestet, mit dem Ziel, den Verlust von Bakteriensporen und Toxinen im Endprodukt zu reduzieren. Zur Qualitätskontrolle von Bti-Produkten und zur Optimierung des Produktionsverfahrens wurde ein Quantifizierungsverfahren für die Bti Toxine auf Basis monoklonaler Antikörper entwickelt (ELISA-Test). Bisher werden die Toxine und Sporen nur indirekt über ihre Wirkung gegen Stechmückenlarven quantifiziert (international toxic units, ITUs). Im Rahmen von mehrjährigen Feldversuchen wurde die Wirkung im Feld optimiert. Neue Formulierungsstrategien wurden entwickelt, um eine höhere Aufnahme des Produkts durch Tipuliden zu fördern und dadurch eine Verringerung der Applikationsdosis von Bti zu gewährleisten.


Ergebnisse und Diskussion

Die Nematodenart Steinernema carpocapsae erwies sich am wirksamsten gegenüber den aus den Eiern schlüpfenden L1 Larven von T. paludosa. Bei unter 14°C wirkt S. carpocapsae nicht mehr, während für Bti eine Wirkung auch noch bei 4°C nachgewiesen werden konnte. Die gute Wirkung konnte auch in Feldversuchen durch Wirkungsgrade von über 80% bestätigt werden. Gegen die weniger anfälligen, ausgewachsenen Insektenstadien (L4) wirken weder Nematoden noch Bti. Weitere Bti-Stämme wurden in Biotests auf gesteigerte Virulenz gegen T. paludosa ohne Erfolg getestet. Während die Wirkung von Bti gegen Mücken auf den Toxinen Cry4A, Cry4B, Cry11Aa und Cyt1Aa beruht, ist sie bei Tipuliden auf Cyt1Aa beschränkt, für das erstmals eine spezifische Bindung und Porenbildung im Darm nachgewiesen wurde. Anders als bei Mücken, tragen die Bakteriensporen wesentlich zur Wirkung bei Tipuiden bei. Zur Quantifizierung der Bti Toxine (Qualitätskontrolle) wurden monoklonale Antikörper hergestellt und erfolg-reich im ELISA getestet. Cry4A und Cry4B können aufgrund der hohen Übereinstimmung der Aminosäuresequenz nicht unterschieden werden. Die Variabilität des ELISA liegt mit 4-8% deutlich unter der des herkömmlichen Biotestverfahrens (20%) mit Mückenlarven. Durch Medienoptimierung wurde die Ausbeute des Cyt1Aa um mehr als das 3-fache gesteigert. Die Wirkung gegen Tipula L1 konnte damit erheblich gesteigert werden (Verringerung des LC50 von 7,5 auf 1 ?g/cm² in Fraßtest mit Salatblättern). Für die Bekämpfung mit Bti wurde eine Sprühformulierung mit verbesserter Haftung auf den Pflanzen entwickelt, wodurch der Wirkungsgrad auf 80% gesteigert werden konnte. Im direkten Vergleich erwies sich allerdings eine Köderformulierung als noch effektiver. Feldversuche mit Bti ergaben variable Ergebnisse aufgrund von Qualitätsunterschieden, die erst nach Verfügbarkeit des ELISA detektiert werden konnten


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Drei Veröffentlichungen in wissenschaftlichen Zeitschriften (Oestergaard, J., Belau, C., Strauch, O., Es-ter, A., van Rozen, K., Ehlers, R.-U. (2006) Biological control of Tipula paludosa (Diptera: Nematocera) using entomopathogenic nematodes (Steinernema spp.) and Bacillus thuringiensis subspec. israelensis. Biological Control 39, 525-531; Oestergaard, J., Voss, S., Lange, H., Lemke, H., Strauch, O., Ehlers, R.-U. (2007) Quality control of Bacillus thuringiensis israelensis products based on toxin quantification with monoclonal antibodies. Biocontrol Science and Technology, im Druck; Oestergaard, J., Ehlers, R.-U., Martínez-Ramírez, A.C., Real, M.D. (eingereicht) Binding and Pore formation of Cyt1Aa and Cry11Aa toxins of Bacillus thuringiensis israelensis to brush border membrane vesicles of Tipula paludo-sa (Diptera: Nematocera). Applied and Environmental Microbiology). Vorträge auf wissenschaftlichen Tagungen (z.B. Deutsche Phytomedizinische Gesellschaft, Society of Invertebrate Pathology, EU COST Ac-tion 850 und 862, Gent Crop Protection Symposium) und bei Anwendertagungen (Greenkeeper-Verband, Beratertagung). Veröffentlichungen in Anwendermagazinen.


Fazit

Untersuchungen zur Aufklärung der Pathogenitätsmechanismen von Nematoden und Bti gegenüber Larven von Tipuliden haben wesentlich dazu beigetragen, die Produktentwicklung zielstrebig voranzuführen. Weiterführende Forschungen sind notwendig, um besonders die Wirkung von Bti weiter zu optimieren. Mit dem ELISA steht ein praxisreifes Verfahren zur Qualitätskontrolle zur Verfügung. Ein Test zur Quantifizierung der Bti Sporen und ein Schnelltest zum Wirkungsnachweis müssen noch entwickelt werden. Umfangreiche Labor- und Feldversuche haben zur Entwicklung einer Bekämpfungsstrategie geführt, bei der Nematoden und Bti zum Einsatz kommen. Sofern die Temperaturen im Herbst über 13°C liegen, kann S. carpocapsae eingesetzt werden. Bei weiter fallenden Temperaturen wird der Einsatz von Bti empfohlen. Bisher sind jedoch nur bei Ausbringung sehr hoher Konzentrationen Wirkungsgrade von 80% zu erzielen. Die damit verbundenen Kosten wären für die Anwendung auf Wiesen und Weiden bisher nicht wirtschaftlich, für die Verwendung auf Sportrasen jedoch interessant. Weitere Optimierungsarbeiten in der Produktion und Formulierung sind notwendig, um das Verfahren auch für Wiesen und Weiden wirtschaftlich zu gestalten. Damit einhergehen müsste ebenfalls eine Maßstabvergrößerung der Produktionsanlage der e-nema GmbH. Da bis jetzt kein chemischer Wirkstoff zur Bekämpfung von Tipuliden zugelassen ist und Versuchsergebnisse mit einem in Entwicklung befindlichen chemischen Wirkstoff eher unter denen von Bti liegen, erscheint die Weiterentwicklung der kommerziellen Anwendung von Bti sinnvoll. Die zur Verfügung stehenden Versuchsergebnisse der Anwendung im Feld reichen für eine Zulas-sung von Bti gegen Tipula-Larven bisher nicht aus, auch weil eine Endscheidung über die optimale For-mulierung auf Basis des verfügbaren Datenmaterials noch nicht möglich ist. Eine Zulassung von Bti gegen Tipula wird weiterhin angestrebt.