Projekt 13663/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: Biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von Pilz-Mangan-Peroxidase

Projektdurchführung

Friedrich-Schiller-Universität JenaBiologisch-Pharmazeutische FakultätInstitut für Angewandte und Ökologische Mikrobiologie
Philosophenweg 12
07743 Jena

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Entwicklung eines kostengünstigen Fermentationsverfahrens zur biotechnologischen Herstellung bisher nicht erhältlicher Pilz-Mangan-Peroxidasen aus neuen Basidiomycetenstämmen, Stabilisierung und Immobilisierung der Enzyme. Erprobung der Mangan-Peroxidasen als innovative Katalysesysteme für unterschiedliche umweltrelevante Einsatzgebiete, mit dem Ziel, neue Anwendungsfelder in der Papier- Textil- und holzverarbeitenden Industrie sowie bei der Eliminierung von Schadstoffen im Umweltbereich oder bei der Entsorgung persistenter Abprodukte im Produktionsprozeß zu erschließen.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Herstellung von Pilz- Mangan-Peroxidasen erfolgt im Rührkesselreaktor in Submerskultur sowie in einem semikontinuierlichen Verfahren unter Nutzung von neuen Pilzkulturen, die auf polymeren Trägern fixiert sind. Die Auswahl der Pilze erfolgt unter den Gesichtspunkten Produktivität, Scherkraft-unempfindlichkeit und Isoenzymspektrum. Es ist vorgesehen, das Verfahren in Hinblick auf hohe Enzymausbeuten mit Hochleistungsstämmen und unter Nutzung kostengünstiger Substrate zu optimieren. Ein Scale-up der Enzymproduktion wird bis zum 300 l Maßstab durchgeführt. Der Einsatz spezieller, aufwendiger Rührsysteme wird durch Verwendung von Stämmen mit geringerer Scherkraftempfindlichkeit vermieden. Die Enzymzusammensetzung der Präparate soll gezielt beeinflußt werden. Unter Anwendung verschiedener Methoden der Proteinchemie werden parallel dazu kostengünstige Schritte zur Reinigung der Enzyme entwickelt und Präparate für die anwendungs-orientierte Testung bereitgestellt. Zeitgleich mit den Arbeiten zur Herstellung der Mangan-Peroxidasen werden neue Anwendungsfelder erschlossen. Schwerpunkte hierbei sind Prozesse der Delignifizierung, die Testung der Abbaubarkeit von Problemstoffen im Umweltsektor. Durch sekundäre Mediatoren werden die Eigenschaften des Katalysesystems so modifiziert, daß beispielsweise Mischkontaminationen, hoch konzentrierte oder sehr toxische Verbindungen umgesetzt werden; Anwendungsbereiche in denen lebende Mikroorganismen nicht zum Einsatz kommen können. Verfahren zur Immobilisierung der Manganperoxidase wurden entwickelt. Die katalytischen Eigenschaften des Enzyms sollten durch die Immobilisierung positiv beeinflußt werden.


Ergebnisse und Diskussion

Im Projektverlauf konnte ein effektives Verfahren zur Herstellung von Manganperoxidase unter Nutzung zweier Pilzstämme aus der Ordnung Agaricales entwickelt werden. Die Induzierbarkeit der Enzymproduktion durch Manganionen setzt voraus, daß diese im Kulturmedium erhalten bleiben und nicht als schwerlösliches Mangandioxid aus dem System entfernt werden. Dem Produktionsmedium muß deshalb entweder ein geeigneter Chelator zugesetztwerden, oder man verwendet ein geeignetes Substrat, aus welchem der Pilz die notwendigen Chelatoren selbst herstellt. Acetat konnte als geeignete Kohlenstoffquelle ermittelt werden aus der der Pilz zusätzlich den notwendigen Chelator in geeigneter Konzentration synthetisieren kann. Die Notwendigkeit zur Reduktion der Scherkräfte, wie aus der Literatur bekannt, besteht nicht. Es konnten reproduzierbar Enzymausbeuten von 2000 U/l, stammabhängig bis 3000 U/l erreicht werden. Unter Einhaltung der ermittelten Verfahrensparameter konnte der Maßstab ohne Einbuße an Produktivität bis 300 l übertragen werden. Das entwickelte Verfahren konnte an andere Produzentenstämme mit modifiziertem Enzymspektrum angepaßt werden.
Der Prozeß benötigt einen Zeitraum von 5-8 Tagen. Nach einer Wachstumsphase von 4 Tagen, in der die Biomasse zunimmt, setzt die Enzymbildung ein und hält ca. 4 Tage an. Danach wird das Produkt nach bekannten Verfahren (Crossflow-Filtration, Ultrafiltration, FPLC ) bis zur gewünschten Qualität gereinigt. Als Nebenprodukt entsteht Oxalat, welches vom Pilz nicht weiter umgesetzt wird.
Es wurde eine zyklische Betriebsweise erprobt, mit dem Ziel, den produktiven Zustand des Pilzmycels über einen längeren Zeitraum zu erhalten. Bei Anwendung von Acetat als Kohlenstoffquelle ändert sich der pH-Wert des Mediums in charakteristischer Weise. Gekoppelt an diese pH-Änderung wurden zyklische Medienwechsel unter Rückführung des Mycels durchgeführt. Die Phase höchster Produktivität konnte so über 10 Zyklen erhalten werden, wobei alle 2-3 Tage geerntet werden konnte. Auf diese Weise konnte die Raum-Zeit-Ausbeute verdreifacht werden.
Die gewonnenen Enzymrohpräparate wurden in verschiedenen Anwendungsbereichen hinsichtlich ihrer Eignung getestet. Bei Prozessen der Delignifizierung innerhalb der Zellstoffherstellung wurde der Weißgrad des Ausgangsmaterials (Kraftpulpe) durch Enzymbehandlung innerhalb von 48 Stunden gesenkt. Dabei wurde jedoch nur eine geringe Erhöhung der Kappazahl bewirkt. Eine Lignindepolymerisation wurde nachgewiesen. Es ist davon auszugehen, daß die Bestimmung der Kappazahl durch die Entstehung von Braunstein (Mangandioxid) verfälscht wird. Zudem wird davon ausgegangen, daß das Enzympräparat am Faserstoff bindet und dabei inaktiviert wird.
Verschiedene polychlorierte Dibenzodioxine und Dibenzofuranrückstände in Klärschlämmen konnten mittels Mangan-Peroxidase-Katalyse innerhalb von 48 Stunden um 50 % verringert werden.
Ebenso konnte ein Gemisch aus TNT und Aminonitrotoluolen in spezifischen Standortwässern von mit Rüstungsaltlasten kontaminierten Standorten mittels Mangan-Peroxidase effizient abgebaut werden. Im Gegensatz dazu waren vorhandene Hexogen- und Hexylkontaminationen schwieriger angreifbar. Bodenproben und wässrige Eluate, welche das Herbizid Hexachlorcyclohexan enthielten waren durch die Enzymkatalyse unter Einsatz verschiedener Mediatoren nicht zu dekontaminieren.
Mit Hilfe der Mangan-Peroxidase gelang es verschiedene Arsenkampfstoffe abzubauen. Mit besonders hoher Rate wurden Chlorvinylarsine umgesetzt (99 % in 30 Minuten), während Phenylarsine vergleichsweise langsam abgebaut wurden. Die Umsetzung arsenorganischer Verbindungen erfolgt ausschließlich in Gegenwart von organischen Schwefelverbindungen. Die persistente Verbindung Tributylzinn, konnte ebenfalls enzymatisch in Gegenwart des Tensids Tween 80 und Glutathion umgesetzt werden. Als Produkte des Tributylzinnabbaus entstanden Di- und Monobutylzinn. Verfahren zur Immobilisierung von Mangan-Peroxidase an anorganische Träger wurden entwickelt. Damit gelang es folgende Eigenschaften des Enzyms zu verbessern: Stabilität gegenüber organischen Lösungsmitteln, Temperaturtoleranz, Aufweitung der optimale Arbeitsbereiche bezüglich Temperatur und pH-Wert.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Ergebnisse des Projektes wurden in 3 Publikationen, einem Patent, 5 Vorträgen, 3 Postern der Öffentlichkeit zugänglich gemacht. Zwei weitere Publikation sind in Vorbereitung.


Fazit

Im Projektzeitraum konnte die Zielstellung 30 l - Fermentation erreicht und auf 300 l erhöht werden. Diese Arbeiten werden mit dem Ziel Kostensenkung fortgesetzt. Mit der zyklischen Betriebsweise konnte ein ebenfalls sehr effektives Verfahren erarbeitet werden. Mit den entwickelten Verfahren sind die Voraussetzungen für Anwendungstestungen im Pilotmaßstab geschaffen. Anwendungsorientierte Testungen der gewonnen Enzympräparate zeigten, daß insbesondere hochtoxische Rückstände und Problemstoffe ein potentielles Anwendungsfeld sind. Die begonnenen Untersuchungen zur Delignifizierung in der Zellstoffherstellung müssen weiter ausgebaut werden. Im Laufe des Projektes haben sich neue Anwendungsfelder ergeben, die weiter verfolgt werden. Die Anwendung der entwickelten Immobilisierungsverfahren führte zu trägergebundenen Enzympräparaten mit deutlich verbesserten Eigenschaften. Diese Arbeiten werden unter dem Anwendungsaspekt fortgeführt.