Projekt 13234/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: ChemBioTec: Nachhaltige biokatalytische Oxidationsprozesse

Projektdurchführung

Universität Greifswald Institut für Biochemie Biotechnologie & Enzymkatalyse
Felix-Hausdorff-Str. 4
17487 Greifswald

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Eine bislang nur unzureichend in der Chemie genutzte Gruppe von Biokatalysatoren sind oxidative Enzyme, obwohl diese es erlauben molekularen Sauerstoff direkt als Cosubstrat zu verwenden und so die Herstellung hochinteressanter funktionalisierter Zwischenstufen bzw. von Endprodukten meist aus nicht-aktivierten Ausgangsverbindungen erlauben. Dies geht weit über die Synthesemöglichkeiten der Chemie hinaus. Zusätzlich kann bei biokatalytischen Verfahren auf die Verwendung toxischer bzw. explosiver Oxidationsmittel verzichtet werden. Hauptgründe für den bisher unzureichenden Einsatz oxidativer Enzyme in der Chemie sind: mangelnde Zahl an verfügbaren Enzymen, problematische Expression, zu niedrige Aktivität, ineffizientes Cofaktorrecycling und Defizite in der verfahrenstechnischen Umsetzung bzw. in der Aufarbeitung.
Diese Probleme sollen in diesem Vorhaben durch einen interdisziplinären Ansatz gelöst werden, bei dem Expertisen aus einer ganzen Reihe von Fachgebieten (Mikrobiologie, Molekularbiologie (insbesondere Expressionssysteme), Proteinengineering, Organische Chemie, Fermentationstechnik, Technische Chemie) gebündelt werden, um effiziente Plattformen zur Herstellung von Chemikalien mittels oxidativer Enzyme zu ermöglichen.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenProjektpartner I (UG)
- Klonierung von BVMO-Genen in Expressionsvektoren
- Affinitätschromatographische Reinigung von BVMOs mittels Äkta®-Purifier
- Etablierung eines Cofaktorrecyclingsystems (Phosphit-Dehydrogenase)
- Chemische Synthese von 4-Hydroxyphenylethanoat
- Gaschromatographische Trennung der Produkte von 4-Hydroxyacetophenon
- Entwicklung/Anwendung von HTS-Assays zur Bestimmung der Aktivität und Regioselektivität
- Methoden der Zufallsmutagenese (error prone PCR; Megawhop PCR)
- Kultivierung und Zellaufschluss im deep-well-MTP-Format
Projektpartner II (UE bzw. UB)
- HPLC, u.a. Anwendung einer Nucleodur®Hilic- und Hypercarb-Säule
- 1H-NMR-Spektroskopie; 13C-NMR-Spektroskopie; UV/VIS-Spektrophotometrie
- Charakterisierung von Biokatalysatoren (insb. Enzymaktivität)
- Präparative Durchführung von Biotransformationen im Labormaßstab
- Aufarbeitung von Reaktionsmischungen (Zentrifugation, Ultrafiltration, Extraktion)
Projektpartner III (TUHH)
- Chirale HPLC-Analytik von cyclischen Ketonen und Lactonen
- UV-spektroskopische Bestimmung von enzymkinetischen Parametern
- Chemische Synthesen unter Stickstoff
- Rektifikation/Destillation von Lactonen und Ketonen
- Entwicklung von Membranreaktoren zur Begasung von Enzymreaktoren
- Enzymkinetische Untersuchungen im Hohlfaserreaktor
Projektpartner IV (UR)
- Bestimmung des Verteilungskoeffizienten von ?-Caprolacton in verschiedenen organischen Lösungsmitteln und Untersuchung des Einflusses von Puffersalzen auf das Extraktionsverhalten
- Aufarbeitung von Stammlösungen (10 g/L Edukt/Produkt) und Realproben (Fermentationsbrühe) - Produktcharakterisierung mittels Karl-Fischer-Titration, NMR und GC-Analytik
- Verdrängungsversuch mit kontinuierlicher Substratabnahme/Produktzunahme zur Simulation einer Fermentation mit Adsorbereinsatz (in situ SFPR-Konzept)
- HPLC-Analytik - Methode analog zur UF
- Reaktionsansätze und online O2-Verfolgung
Projektpartner V (TUD)
- Aktivitätsassays mit ruhenden Zellen
- Standard Klonierungstechniken
- Aufbau und Betrieb des tubulären Mikroreaktorsystems (siehe Anhang)
Projektpartner VI (UF)
- Klonierung von Prolinhydroxylase-Genen in Expressionsvektoren
- Enzymisolierung über His6-tag
- SDS-PAGE, Aktivitätstests mittels HPLC- und Farbassay
- Kultivierung von E. coli und Ganzzellbiokatalyse
- Ionenaustauschchromatographie
- gerichtete Mutagenese (QuikChange)
- Fluoreszenz-HPLC-Chromatographie; 1H-NMR- und 13C-NMR-Spektroskopie
Projektpartner VII (UA)
- Gen-Klonierung durch Phosphorothioate-based ligase-independent gene cloning
- Expression von rekombinanten Proteinen in Schüttelkolben und im MTP-Format
- Proteinanalyse/ Quantifizierung: SDS-PAGE, CO-Differenzspektroskopie, Enzymaktivitätstests
- Ionenaustauschchromatographie zur Proteinaufreinigung
- Biokatalyse in vitro und im Ganzzellsystem
- Gaschromatographische Trennung der Produkte
- Polarimetrie zur Ermittlung von chiralen Substanzen (Enantiomere)
- Fermentation (5-10 L-Maßstab)
- Durchmusterungssysteme: NADPH-Nachweissystem; ABTS-Assay
- Mutagenesemethoden: ortsgerichtete Sättigungsmutagenese; epPCR; Megawhop PCR
Projektpartner XIII (HHUD)
- Verschiedene Screeningmethoden (Anreicherungs-Screening, in silico-Screening)
- Mikrobiologische Standardmethoden der Mikroorganismen-Kultivierung
- Fermentation im 40 L-Maßstab
- Hochzelldichtefermentation
- Mutagenese durch error-prone-PCR
- PCR; Klonierung unter Verwendung von E. coli als Wirt
- Proteinexpression
- Photometrische Enzymaktivitätstests; SDS-PAGE
- Proteinreinigung mittels FPLC (Äkta)
Projektpartner IX (BRAIN)
- Klonierung verschiedener prokaryotischer BVMO-kodierender Gene
- Sequenzierung der Gene, bioinformatische Analyse der Sequenzen
- Klonierung in Expressionsvektoren für S. albus bzw. S. lividans und E. coli
- Rekombinante Expression der BVMOs in S. albus bzw. S. lividans und E. coli
- Aufreinigung bzw. Aufkonzentrierung von BVMOs
- Aktivitätsbestimmungen mittels spektroskopischer und GC/MS-Analytik
- Biotranformationen mit BVMO-Ganzzellkatalysatoren im 1 L Maßstab
Projektpartner X (Enzymicals AG)
- Proteinexpression im 20 L-Maßstab (Fermenter)
- Zellaufschluss mittels Hochdruckhomogenisator bzw. Ultraschall
- Gefriertrocknung/Sprühtrocknung
- Biokatalysen im Ganzzellsystem
- Extraktion aus Biokatalyseüberstand


Ergebnisse und Diskussion

Teilprojekt I: P450- und BVMOs zur Herstellung von Bulk- und Feinchemikalien
Universität Greifswald (UG, Prof. Bornscheuer)
Durch Codon-Optimierung des Gens der 4-Hydroxyacetophenon-Monooxygenase aus P. putida JD1 (HAPMO), Anpassung der Klonierungsstrategie und Überarbeitung des Kultivierungsprotokolls konnte die funktionelle Expression und Aufreinigung deutlich verbessert werden. Weiterhin wurde durch epPCR eine Zufallsmutantenbibliothek sowohl der HAPMO als auch der Cyclohexanon-Monooxygenase aus A-cinetobacter calcoaceticus (CHMO) generiert, deren vielversprechendste Varianten genauer untersucht wurden. Eine Sättigungsmutantenbibliothek der HAPMO wurde ebenfalls angelegt. Zudem wurden zwei Hochdurchsatz-Assaysysteme zur Analyse der Aktivität bzw. Regioselektivität von BVMOs entwickelt. Es konnten drei neue BVMOs aus P. putida NCIMB rekombinant hergestellt und charakterisiert werden. Die biotechnologische Anwendbarkeit der zwei neuen Enzyme, die zur Subklasse II der BVMOs gehören, wurde durch die Kopplung mit einer Flavin-Reduktase aus E. coli verbessert.
Universität Erlangen-Nürnberg bzw. Universität Bielefeld (UE/UB, Prof. Gröger)
Die P450-Monooxygenase-katalysierte Hydroxylierung wurde mit n-Oktan und n-Butan durchgeführt unter Anwendung einer in situ-Cofaktorregenerierung mit einer Glucosedehydrogenase. Hierbei erwies sich die Reaktionsdurchführung mit n-Oktan bei 8°C für 8 h und erst anschließendem Erwärmen auf Raumtemperatur als günstig. Zudem gelang auch die Hydroxylierung des Flüssiggases n-Butan. In einem "Proof of Concept" wurde 2-Butanol hochregioselektiv mit einer Produktbildung von 170 mg/L gebildet. Auch wurde die Oxidation von 2-Butanol mit einer ADH und einer NADH-Oxidase untersucht und hierbei Butanon mit 52% Ausbeute (Produktbildung: 2.2 g/L) erhalten. Das Konzept der biokatalytischen Doppeloxidation wurde zudem erfolgreich für die Direktsynthese von ?-Caprolacton aus Cyclohexanol mittels einer BVMO und einer ADH sowie Sauerstoff demonstriert, wobei Umsätze von bis zu 99% bzw. 94% bei Substratkonzentrationen von 20 mM bzw. 60 mM erhalten wurden. Bei einer weiteren Erhöhung der Substratkonzentration auf bis zu 100 mM nahm der Umsatz jedoch merklich ab, so dass im Folgenden die Inhibierung und die Stabilität der BVMO gegenüber Edukt (Cyclohexanol), Zwischenprodukt (Cyclo-hexanon) und Produkt (?-Caprolacton) untersucht wurde. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die bisher eingesetzte BVMO bei hohen Konzentrationen am Produkt Caprolakton so-wohl inhibiert als auch deaktiviert wird. Zusätzlich zeigt sich aber auch in Abwesenheit dieser Komponenten eine Aktivitätsabnahme der BVMO.
RWTH Aachen (UA, Prof. Schwaneberg)
Mittels semi-rationalen Designs wurde eine Cytochrom P450 BM-3 Mutante erstellt, die mit zwei Mutationen (R255P/P329H) eine erhöhte Aktivität gegenüber n Heptan, sowie eine signifikant veränderte Regio- und Enantioselektivität im Vergleich zum Wildtyp-Enzym zeigt. Die Oxidationsraten und Kopp-lungseffizienz der generierten P450 BM-3 Mutante, der Referenzvariante 19A12 und des Wildtyp-Enzyms wurden zur Charakterisierung bestimmt. Als Modellsubstrat wurde n-Heptan für mittel- bis kurzkettige Alkane verwendet. Daneben wurde das biokatalytische Konzept einer "one-pot" Doppeloxidation von n-Heptan sowohl in vitro als auch in vivo, mit der P450 BM-3 Monooxygenase und der Alkoholdehy-drogenase aus Rhodococus erythropolis untersucht. Um eine enzymgekoppelte Regenerierung des Cofaktors realisieren zu können, wurde durch gezielte Mutagenese die Cofaktorspezifität der P450 BM-3 von NADPH zu NADH verändert. Der in vitro Ansatz mit aufgereinigtem Enzym erzielte eine maximale Produktkonzentration von 164 mg/l. Eine Erweiterung des Systems auf ganze Zellen wurde durch Co-Expression beider Enzyme erfolgreich durchgeführt und 162 mg/L Produkt wurden gebildet.
BRAIN AG (BRAIN, Dr. Eck)
Das Ziel der Untersuchungen war die Evaluation von Streptomyces albus als Expressionsplattform für die Gewinnung von BVMO-Ganzzellkatalysatoren. Verschiedene Maßnahmen, wie etwa die Optimierung der Transkription und Translation, führten in Kombination zu einer Steigerung der Protein-Ausbeute für einen BVMO-Katalysator. Allerdings konnte keine Steigerung der Aktivitätsausbeute erzielt werden. Verschiedene Beobachtungen deuten darauf hin, dass eine starke Steigerung der BVMO-Aktivität für die Zellen nicht tolerabel ist. Daher erscheint die Nutzung von S. albus als Wirt zur Gewinnung dieser BVMO schwierig und eine weitere Optimierung im Vergleich zu einer E. coli-basierten Expression mit deutlich mehr Aufwand verbunden. In E. coli konnte dagegen die Aktivitätsausbeute eines BVMO-Ganzzellkatalysators durch Fusion einer CHMO mit Löslichkeits-steigernden Proteinen deutlich verbessert werden, insbesondere durch Erhöhung der Löslichkeit in Gegenwart des Reaktionsprodukts Caprolacton, das ab einer Konzentration von 10 g/l für eine Aggregation und Inaktivierung des Enzyms sorgte. Damit konnten die geplanten Ziele (Meilensteine) erreicht und durch die Steigerung der Aktivitätsausbeute für die CHMO ein Beitrag zur Optimierung eines Biotransformations-Prozesses geliefert werden.
Enzymicals AG (EC, Dr. Menyes)
Die Enzymicals AG konnte die vorgesehenen Meilensteine M5 und M16 fristgerecht erreichen und hat im Rahmen der Kooperation Projektpartner mit BVMO-Präparaten versorgt. Die Expression der CHMO wurde im 20 L-Maßstab etabliert und die erhaltene Biomasse in Biokatalysen im Ganzzellsystem ver-wendet, um Cyclohexanon zu ?-Caprolacton umzusetzen. Weiterhin wurden im Verlauf des Projektes verschiedene Additive in der Gefriertrocknung für die CHMO getestet, um für die Arbeit in Laboren akti-vere CHMO-Präparate zur Verfügung stellen zu können. Des Weiteren wurden auch einzelne Schritte der Aufarbeitung der Ganzzellbiokatalyse betrachtet und optimiert, dazu gehören zum Beispiel die Beseitigung von natürlichen Bioemulgatoren und Untersuchungen zum in situ substrate feed and product re-moval (SFPR) mit Hilfe von Adsorberharzen.
SeSaM-Biotech GmbH (SeS, Dr. Behrendt)
Der Beitrag von SeSaM-Biotech im Rahmen des DBU-Antrages, war die Bereitstellung von hochqualitativen Mutantenbibliotheken für den Kooperationspartner RWTH Aachen. Diese wurden erstellt und dem Kooperationspartner zur weiteren Bearbeitung übergeben.
Teilprojekt II: Prolinhydroxylasen zur Herstellung chiraler Bausteine
Universität Freiburg (UF, Prof. Müller)
In Teilprojekt II wurde die katalytische Aktivität der Prolinhydroxylasen mit Hilfe eines dazu entwickelten HPLC-Assays mit verschiedenen Substraten getestet sowie der Einfluss der Konzentration von Cofaktoren und Sauerstoff auf die Stabilität der Enzyme untersucht. Als ökonomisch aussichtsreiche Produktionsmethode erwies sich die in vivo Biotransformation mit E. coli-Kulturen, die für eine Vielzahl von En-zym-Substrat-Kombinationen anwendbar ist. Dies wurde im Labormaßstab anhand der Synthese zweier synthetisch interessanter Bausteine (trans-5 Hydroxypipecolinsäure und trans-2,3-cis-3,4-Dihy-droxyprolin) demonstriert, deren chemische Synthese einen Vielstufenansatz erfordern würde.
Teilprojekt III: NADH-Oxidasen zur Herstellung von ?-Ketoglutarsäure
Universität Erlangen-Nürnberg bzw. Universität Bielefeld (UE/UB, Prof. Gröger)
Der Hauptfokus lag auf synthetischen Biotransformationen zur Synthese von ?-Ketoglutarat aus L-Glu-tamat mittels L-Glutamatdehydrogenasen (L-GluDH) und Sauerstoff als Oxidationsmittel sowie unter in situ-Cofaktorregenerierung des Cofaktors NAD+ mittels einer NADH-Oxidase. Nach Etablierung der Analytik zur Charakterisierung und Reaktionskontrolle sowie Untersuchungen zur Stabilität von ?-Ketoglutarat erfolgte u.a. die Untersuchung des Einflusses erhöhter Substratkonzentrationen. Hierbei zeigte sich eine Produktinhibierung bei pH 8. Aufgrund des positiven Einfluss hoher pH-Werte im Hinblick auf verminderte Produktinhibierungen bestand danach die Herausforderung darin, Biotransformationen bei hohen pH-Werten von pH 9-10 durchzuführen. Zur Entwicklung eines auch bei höheren pH-Werten stabilen Systems zur Cofaktorregenerierung wurde evaluiert, inwieweit "biomimetische" Metall-Komplexe die Funktion der NADH-Oxidase ausüben und damit als Ersatz für die bei hohen pH-Werten (in freier Form) instabile NADH-Oxidase eingesetzt werden können. Erstmalig konnte die Eignung eines Eisenporphyins als "artifizielles Enzym-Analoga" für die Bildung von ?-Ketoglutarat gezeigt werden (89% produktbezogener Umsatz bei pH 8), allerdings verliefen die Versuche bei pH-Werten (pH 9-10) nicht erfolgreich und ergaben niedrige Umsätze. Demgegenüber gelang ein "proof of concept" für die Umsetzung von Glutamat zu dem ?-Ketoglutarat mittels einer L-GluDH bei erhöhten pH-Werten, indem eine NADH-Oxidase als Ganzzellkatalysator eingesetzt wurde. Dabei konnte bei 50 mM Substratkonzentration nach 24 h ein Produktbezogener Umsatz von 66% an ?-Ketoglutarat erzielt werden. Allerdings konnte insgesamt der Umsatz im Vergleich zu den Biotransformationen bei pH 8.0 nicht gesteigert werden. Darüber hinaus wurde mit dem AK Prof. Hummel an einem alternativen Synthesezugang gearbeitet.
Universität Düsseldorf (HHUD, Prof. Hummel)
Für die enzymkatalysierte Herstellung von ?-Ketoglutarat durch oxidative Deaminierung von L-Glutamat wurden verschiedene enzymatische Wege vergleichend untersucht. Erste Versuche mit kommerziell verfügbaren Glu-DH hatten gezeigt, dass diese Enzyme einer starken Produktinhibierung durch Ketoglutarat unterliegen. Ein umfangreiches Screening führte zu weiteren mikrobiellen Enzymen. Präparative Umsetzungen, die in Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis Prof. Gröger erfolgten, haben allerdings gezeigt, dass auch diese Enzyme einer zwar schwächeren, aber weiterhin deutlichen Produktinhibierung bei höheren pH-Werten deutlich schwächer ist. So konnte die Aktivität der GluDH von Fusobacterium nuclea-tum in Gegenwart von Ketoglutarat von 52% Restaktivität bei pH 8 auf 94% bei pH 10 gesteigert werden. Eine präparative Anwendung der verfügbaren GluDHs mit einem praktisch vollständigen Umsatz war allerdings nicht möglich, eine Produktinhibierung machte sich bereits in Umsetzungen von Glutamat-Konzentrationen >25 mM bemerkbar. Neben diesen detaillierten Untersuchungen mit mehreren GluDHs wurden weitere Enzymsysteme untersucht, dabei zeigte sich, dass es mit alternativen Enzymen möglich ist, höhere L-Glu-Konzentrationen von 100 mM und höher vollständig zu Ketoglutarat umzusetzen. Ergänzend wurde ein weiterer Synthesezugang zu ?-Ketoglutarat untersucht. Hierbei konnte ein Herstellungsverfahren für diese Ketosäure erfolgreich entwickelt werden, zudem gegenwärtig eine Patentierung vorbereitet wird.
Verfahrenstechnik (teilprojektübergreifend)
Universität Rostock (UR, Prof. Kragl)
In Teilprojekt II bestätigt das O2-Sensor-Screening eine sehr geringe Halbwertszeit der isolierten trans-P4H und eine starke Beeinflussung des Gelöstsauerstoffgehaltes durch FeSO4-Zusätze. Angesichts der aufwendigen Isolierung und anschließende Aufreinigung des Zielproduktes in sehr verdünnter Lösung (Umsätze von 0,2 g/L, in Einzelfällen auch bis zu 0,5 g/L) ließen sich weder in vitro noch in vivo vertretbare Methoden für den technischen Maßstab finden.
In Teilprojekt I wurden in der AG Kragl verschiedene Aufarbeitungsvarianten (diskontinuierlich/kontinuierlich) für ?-Caprolacton untersucht. Die Schwerpunkte lagen zum einen in der Extraktion des Zielproduktes aus einer wässrigen Fermentationsbrühe und zum anderen in der Auswahl und dem Re-cycling geeigneter Adsorber für das SFPR-Konzept zu Realisierung des 0,1-1 kg Maßstabes.
Technische Universität Dortmund (TUD, Prof. Schmid)
Zur kontinuierlichen Umsetzung von Cyclohexan zu Cyclohexanol wurden die Alkanmonooxygenase (AlkBGT) aus P. putida GPO1, sowie die Cytochrom P450 CypP153A6 aus Mycobacterium sp. Strain HXN-1500 eingesetzt. Beide Enzymsysteme wurden auf "broad-host-range" Vektoren kloniert, welche sowohl in Pseudomonaden als auch in E. coli erkannt werden. Als Wirtsstämme kamen rekombinante Biofilme aus Pseudomonas VLB120 (alkBGT) und Pseudomonas KT2440 (cyp156A6) in kapillaren Mikroreaktoren zum Einsatz. Obgleich die volumetrischen Aktivitäten relativ niedrig sind (zwischen 3 und 5 U/L), wurde kontinuierlich über 25 Tage Cyclohexanol produziert.
Technische Universität Hamburg-Harburg (TUHH, Prof. Liese)
Es konnte gezeigt werden, dass sich auf Basis der Reaktion von cyclischen Ketonen mit einer Cyclohe-xan-Monooxygenase stereoselektiv verschiedene ungewöhnliche Lactone mit ee-Werten von bis zu 80% erhalten lassen, die bei Kopplung mit einer Hydrolase-Spaltung zu pharmakologisch interessanten Wirkstoffen führen. Wesentliche Problematik und damit Schlüssel zum Erfolg im Rahmen dieser Zielsetzung war die Entwicklung eines Reaktorkonzeptes zur optimalen Begasung der CHMO unter Berücksichtigung gleichzeitig destabilisierender Effekte von Sauerstoff auf das Enzymsystem. Diesbezüglich konnte ein Membranbegasungs-Reaktor entwickelt werden, der für die CHMO-Katalyse eine um den Faktor zehn verbesserte Raum-Zeit-Ausbeute erlaubte. Hieraus resultierte ein Membranreaktor, der deutlich leistungsfähiger als alle bisherigen Konzepte war. Prinzipiell handelte es sich bei diesen Ergebnissen um allgemeingültige Erkenntnisse, die auch auf andere enzymatische Oxidationsreaktionen übertragbar sein sollten und damit weit reichenden Zusatznutzen für den Einsatz von Enzymen nicht nur im Rahmen der Baeyer-Villiger-Oxidation haben.





Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

ESBES, 2012, Istanbul, Türkei; Vortrag R. Karande (TUD) Segmented flow biofilm microreactors.
Bioverfahrenstechnik an Grenzflächen, 2011, Potsdam; Vortrag R. Karande Segmented flow capillary microreactors: a tool for bio-process intensification.
Biotrends, 2011, Poster R. Karande Applications of segmented flow microreactor for biocatalysis, Dortmund
Biotrans 2011, Sizilien, Italy; Poster Christina A. Müller Reengineering P450 BM-3 monooxygenase for industrial applications: production of bulk chemicals.
Biocat 2012, Hamburg; Poster Christina A. Müller Enzyme-coupled cofactor regeneration during double-oxidation of alkanes in one-pot.
Biotechnica 2011, Hannover, Vortrag Behrendt D. Diversity for Proteins


Fazit

Während der Projektlaufzeit ist es allen Partnern im Konsortium gelungen, die wesentlichen Projektziele und die Meilensteine gemäß Planung zu erreichen. Die verschiedenen Reaktionssysteme konnten erfolgreich grundlegend etabliert werden und es konnte für alle geplanten Biokatalysen gezeigt werden, dass die gewünschten Reaktionsprodukte gebildet werden. In den meisten Fällen konnte dies auch in präparativen Ansätzen bestätigt werden. Parallel dazu wurden für die verschiedenen Plattformen (Enzymherstellung, Assaysysteme, Reaktionssysteme usw.) wesentliche Fortschritte erzielt. Der Austausch von Enzymproben bzw. Substraten und des Know-hows zwischen den Verbundpartnern erfolgte nach Plan.