Projekt 13225/01

örderschwerpunkt Biotechnologie: ChemBioTec: Entwicklung eines innovativen Produktionsverfahrens zur umweltfreundlichen Synthese der Modellverbindungen (R)-1-Phenylethanol und 7-Hydroxymethotrexat durch Einsatz der neuartigen Enzymklasse pilzlicher […]

Projektdurchführung

Hochschule Lausitz (FH) FB Bio-, Chemie- und Verfahrenstechnik FG Enzyme Technology
Großenhainer Str. 57
01968 Senftenberg

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Anlass des vorliegenden Verbundvorhabens waren extrazelluläre unspezifische Peroxygenasen aus Basidiomyceten, welche bisher kommerziell noch nicht verfügbar sind.
Die spektroskopischen und katalytischen Besonderheiten dieser Enzyme lassen eine Zwischenstellung (missing link) zwischen Häm-Thiolat-Haloperoxidasen und Cytochrom-P450 Monooxygenasen (Hydroxylasen) vermuten und zukünftig eine hohe biotechnologisch-industrielle Bedeutung prognostizieren. Obgleich eine Reihe biotechnologisch interessanter Enzyme, die industriell relevante Oxygenierungen katalysieren existiert, können diese bisher aufgrund ihres intrazellulären Vorkommens und komplexer Anforderungen an Kosubstrate und Hilfsproteine technisch noch nicht eingesetzt werden oder nur als Ganzzell-Katalysatoren fungieren. Im Rahmen des Vorhabens sollten Peroxygenasepräparate in ausreichenden Mengen für die Anwendung in der Biokatalyse zur Verfügung gestellt werden. Dies beinhaltete sowohl die Enzymgewinnung durch Wildstamm-Kultivierung, als auch Möglichkeiten zur heterologen Expression von Peroxygenasen.
Ziel war es, das regio- und enantioselektive Katalysepotenzial für industrielle Verfahren am Beispiel
der stereoselektiven Oxyfunktionalisierung von Ethylbenzol zu (R)-1-Phenylethanol (einem chiralen Auxiliar für die chemische Industrie und Ausgangsstoff für Duft- und Kosmetikprodukte) und der regioselektiven Hydroxylierung von Propranolol zu 5-Hydroxypropranolol (einem humanen first pass Lebermetaboliten, der für pharmakologische Untersuchungen benötigt wird) zu ermitteln. Die entwickelten Verfahren wurden projektbegleitend über Ökoeffizienzanalysen mit bekannten chemischen und biotechnischen Verfahren verglichen und entsprechend weiterentwickelt.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenMittels Submerskultivierung und Fermentation wurden peroxygenasehaltige Rohenzymextrakte von Agrocybe aegarita und Coprinellus radians gewonnen, über FPLC-Säulen gereinigt und für die enantioselektive Synthese von (R)-1-Phenylethanol sowie für die regioselektive Synthese von 5-Hydroxypropranolol (als Ersatz zu 7-Hydroxymethotrexat) eingesetzt. Beide Produkte wurden selektiv durch einstufige Hydroxylierungsreaktionen aus Ethylbenzen beziehungsweise Propranolol unter Einsatz von Wasserstoffperoxid als molares Kosubstrat hergestellt. Im Mittelpunkt der enzymkatalysierten Synthesen im analytischen Maßstab standen dabei die Einflüsse variabler Reaktionsparameter in Bezug auf maximale Produktausbeute, Enantiomerenverhältnis sowie die Bildung von Nebenprodukten. Parallel dazu wurde die Enzymkatalyse zur quantitativen Darstellung von 5-Hydroxypropranolol und (R)-1-Phenylethanol unter Produktisolation und Substratrückgewinnung etabliert. Die Analyse der entstandenen Produkte erfolgte mittels HPLC, GC-MS und Dünnschichtchromatographie. Auf der Grundlage von ermittelten Sequenzdaten zum AaP-Gen (entspr. E. coli-Klone) und zur AaP-Aminosäuresequenz (peptide mapping, N-termini, etc.) sollten diese Peroxygenasen weiterhin heterolog produziert werden.


Fazit

Innerhalb des abgeschlossenen Verbundvorhabens konnten pilzliche Peroxygenasen aus Agrocybe aegeritaund Coprinellus radians erstmalig als zellfreie, selektiv oxyfunktionalisierende Enzymsysteme industriell verfügbar gemacht werden. Für die eingesetzten Modellsubstanzen ((R)-1-Phenylethanol und 5-Hydroxypropranolol) konnte mit den beschriebenen Peroxygenase-Verfahren ein völlig neuer Lösungsansatz zur Herstellung und Gewinnung dieser Verbindungen aufgezeigt werden. Die ermittelten Umweltbewertungszahlen sind bei beiden Peroxygenase-Verfahren gleichwertig oder deutlich besser als bisherige chemische oder biotechnologische Verfahren. Änderungen in der Zielsetzung wurden insoweit notwendig, da nach Umsetzung von Methotrexat nicht der gewünschte Metabolit 7-Hydroxymethotrexat identifiziert werden konnte. Bedingt dadurch wurde diese Modellverbindung durch Propranolol ersetzt. Die Herstellung der homolog exprimierten Enzyme konnte erfolgreich bis in den 30 l Maßstab überführt werden. Die heterologe Expression der pilzlichen Peroxygenasen konnte durch die Expression zweier Peroxygenasen aus Coprinus cinereus gelöst werden. Die in diesem Projekt hergestellten und charakterisierten Peroxygenasen sind hinsichtlich ihres Spektrums an nachhaltigen Oxyfunktionalisierungsreaktionen, ihrer einfachen Handhabbarkeit und Effizienz als sehr innovativ einzustufen. Auf Basis der umfangreich publizierten Ergebnisse und der entwickelten Methoden und Verfahren werden weiterführende Untersuchungen u.a. in einem BMBF- unterstützten Forschungs- und Entwicklungskooperationsverbund durchgeführt.