Projekt 13220/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: ChemBioTec: Umweltschonende und effiziente Produktion von Cortisol sowie nicht radioaktiver, Isotopen markierter P450-Metaboliten-Referenzstandards mittels Biotransformation

Projektdurchführung

Universität des Saarlandes Naturwissenschaftlich-Technische Fakultät III Lehrstuhl für Biochemie
66041 Saarbrücken

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Es sollte ein innovatives biotechnologisches Verfahren zur Produktion von Isotopen-markierten Metaboliten-Referenzstandards etabliert werden, das auf einer Cytochrom P450-abhängigen Biotransformation beruht. Als Mikroorganismus für diese Biotransformation sowie für die Cortisolproduktion wurden rekombinante Spalthefen (Schizosaccharomyces pombe) eingesetzt, die die relevanten humanen Cytochrom P450-Enzyme (und ihre Hilfsproteine) exprimieren. Eine optimierte prozesstechnische Verfahrensführung im Bioreaktor soll im Vergleich zu den bisher eingesetzten chemischen Herstellungsverfahren umweltgerechtere, Ressourcen-schonendere und rentablere Prozesse erlauben.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Projektpartner vereinen ihre nachgewiesene Expertise im Bereich der P450-Enzyme (Prof. R. Bernhardt), der P450-abhängigen Biotransformation mit rekombinanten Spalthefen (PomBioTech GmbH) sowie der Prozessentwicklung und -optimierung (Dr. S. Lütz, Prof. C. Lang), um ein ökonomisch tragfähiges und ökologisch sinnvolles Produktionsverfahren für literaturbekannte Cytochrom P450-Referenzstandards (z. B. 6ß-Hydroxytestosteron, 3-Hydroxyibuprofen, 4-Hydroxydiclofenac) zu entwickeln, die mit nicht-radioaktiven Isotopen markiert sind.
Die Aufgaben der AG Bernhardt umfassen Molekularbiologische Erzeugung von cDNAs für P450-Enzyme mit erhöhter Aktivität durch Mutagenese sowie die Entwicklung eines Roboter-gestützten Screening-Verfahrens zur schnellen Testung der P450-Aktivität. Die Aufgaben der PomBioTech GmbH beinhalten die Produktion der Zielsubstanzen mit bereits vorhandenen Spalthefestämmen im Labormaßstab, die Klonierung von neuen Spalthefestämmen sowie die Testung der neuen Stämme der von der AG Bernhardt entwickelten Enzyme im Labormaßstab. Die Aufgaben des IBT 2 (dieser Projektpartner ist zum Juni 2009 aus dem Verbund ausgeschieden, als neuer Partner konnte dafür die Organobalance GmbH gewonnen werden) bzw. der Organobalance GmbH waren die Prozessentwicklung und -optimierung der vorhandenen Verfahren unter Verwendung der von der PomBioTech zur Verfügung gestellten Spalthefestämme.


Ergebnisse und Diskussion

Um eine effiziente und umweltgerechte Herstellung von Metaboliten zu erreichen, wurden im Rahmen des Projekts drei Cytochrom P450-Enzyme molekularbiologisch optimiert und untersucht. Dazu wurde erfolgreich ein Roboter-unterstütztes Durchmusterungsverfahren für die molekularbiologische Optimierung von Cytochrom P450 Enzymen in Hefen entwickelt und verwendet. Eine solche Durchmusterung im Ganzzell-Hefesystem ist sehr anspruchsvoll und konnte bislang international nur in wenigen Fällen demonstriert werden. Desweiteren wurde ein neues Verfahren für die Plasmidisolierung aus Spalthefen entwickelt und erfolgreich genutzt. Ca. 3000 Hefe Klone wurden mit Hilfe der HPLC analysiert. Dabei konnten zwei CYP3A7- und drei CYP11B2-Mutanten mit gesteigerten Enzymaktivitäten identifiziert wer-den. Basierend auf diesen Ergebnissen konnte weiterhin ein Roboter-unterstütztes Durchmusterungsverfahren für die Untersuchung der Wechselwirkung von Fremdstoffen mit dem Leber Cytochrom CYP3A4 entwickelt und erfolgreich eingesetzt werden.
Aufbauend u. a. auf diesen Ergebnissen konnte die Produktion einer ganzen Reihe von P450-Metaboliten (wie z. B. 6ß-Hydroxytestosteron, Sorafenib N-Oxid und 3-Hydroxyibuprofen) gezeigt werden, und zwar sowohl von unmarkierten Metaboliten als auch von solchen, die mit stabilen Isotopen markiert sind. Der Produktionsmaßstab reichte hierbei bis zur Größenordnung von 5 g, was in Anbe-tracht der hochpreisigen Verbindungen als durchaus nennenswert zu bezeichnen ist. Zur Optimierung der Ganzzell-Biotransformation wurde unter anderem das sog. Design of Experiment (DoE) eingesetzt. Weiterhin erfolgte eine Erweiterung des zur Verfügung stehenden Spektrums an CYP-Enzymen; neben der Expression zusätzlicher humaner CYP-Isoenzyme konnten zudem durch die Kombination aktivierter polymorpher Varianten bei den Vertretern der CYP3A-Familie zum Teil erhebliche Umsatzsteigerungen erreicht werden. Alle diese positiven Resultate ermöglichen jetzt eine effiziente und umweltgerechte Herstellung ausgewählter Isotopen-markierten Metaboliten-Referenzstandards.
Was die Optimierung des Prozesses der Cortisolherstellung aus 11-Deoxycortisol mittels Ganzzell-Biotransformation angeht, so lässt sich festhalten, dass eine signifikante Steigerung der Cortisolbildungsrate erreicht werden konnte. Stellt man einen Vergleich zwischen den Cortisolkonzentrationen im nicht optimierten Prozess und im optimierten Prozess an, so konnte der Prozess nur mit der Optimierung der Biomasse und Substratmenge im Biotransformationsansatz um den Faktor 13 verbessert werden. Bei der Zusammenführung aller einzelnen Optimierungsergebnisse (z.B. der Einsatz von 2 % (v/v) Saccharose im Assay und 0,1 % (v/v) Tween80 vor und während der Biotransformation, die Verwendung von Zellen aus der stationären Wachstumsphase) ist zu erwarten, dass eine noch höhere Steigerung der Ausbeute zu erzielen ist. Der Prozess der Biotransformation mithilfe des S. pombe Stammes SZ1 von 11-Deoxycortisol zu Cortisol konnte somit stark verbessert werden, wodurch die Wirtschaftlichkeit und Ökoeffizienz des gesamten Prozesses gesteigert wird. Wie die durchgeführte Ökoeffizienzanalyse ergab, konnte durch die Prozessoptimierung bei der Cortisolproduktion aus ökologischer Sicht eine klare Verbesserung um einen Faktor von ca. 40 erreicht werde. Jedoch ist beim bisher erreichten Entwicklungsstand die Produktqualität (bedingt durch den geringen Umsatz und die schwierige Abtrennung des chemisch ähnlichen Edukts) noch nicht ausreichend, so dass hier weitere Arbeiten erforderlich sind, um den Prozess konkurrenzfähig zu gestalten. Aus den bisherigen Arbeiten ergeben sich dafür zahlreiche Ansatzpunkte.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Am 3.9.2008 wurde eine Pressemitteilung mit dem Titel Eine halbe Million Euro für effizientere biotech-nologische Produktionsverfahren von der Universität des Saarlandes veröffentlicht. Weiterhin wurde Tei-le der Projektergebnisse auf 5 internationalen Kongressen vorgestellt. Es entstanden bis jetzt fünf Publikationen, drei weitere befinden sich in Vorbereitung. Außerdem wurde ein Beitrag für BioChemTech Reviews erstellt und publiziert.


Fazit

Es wurden neue Verfahren entwickelt (durch ortsgerichtete Mutagenese bzw. gerichtete Evolution von Cytochromen P450 und Nutzung der verbesserten Proteine in einem Spalthefe-Ganzzellsystem), die eine effizientere Produktion von Arzneimittelmetaboliten für die Produktion von Isotopen-markierten Referenzstandards erlauben. Weiterhin konnte die Cortisolproduktion durch Prozessoptimierung aus ökologi-scher Sicht um den Faktor 40 verbessert werden.