Projekt 13164/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: Neuartige Biokatalysatoren aus Basidiomyceten für die Lebensmittelindustrie

Projektdurchführung

N-Zyme BioTec GmbH
Haasstr. 9
64293 Darmstadt

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Die Einführung moderner Enzymtechnologien in der verarbeitenden Industrie führt zur Substitution umweltbelastender, energieaufwändiger und emissionsreicher chemischer Verfahren und chemisch synthetisch hergestellter Produkte durch ökologisch kompatiblere biotechnologische Alternativen. Der Schlüssel zu einer breiten Etablierung ökonomisch und ökologisch vorteilhafter Prozesse liegt in der Verfügbar-keit hocheffizienter und stabiler Biokatalysatoren. Aufgrund ihrer Befähigung zum Aufschluss lignifizierter Biopolymere besitzen Pilze aus der Klasse der Basidiomyceten eine einzigartige Enzymausstattung. Zu den mehreren hundert potenziellen extrazellulären Basidiomyceten-Enzymen gehören u. a. Glycosida-sen, Peptidasen und Lipasen.
Ziel des Projekts war es, dieses bisher ungenutzte biochemische Potenzial im Sinne einer Plattformtechnologie für Prozesse und Produkte der weißen Biotechnologie verfügbar zu machen. Dazu zählen die Entdeckung und biochemische Charakterisierung folgender Enzyme: prolinspezifische Peptidasen für den Einsatz in der Getränkeindustrie, Glykosidasen mit neuen katalytischen Eigenschaften ebenfalls zur Verwendung in der Getränkeindustrie, Lipasen und Esterasen für die Aromabiotechnologie, die Wasch-mittel-, Futtermittel- und Lebensmittelindustrie sowie polyvalente Peroxidasen zur Synthese von Fein-chemikalien. Ebenfalls sollte die Eignung der Enzyme für die aufgeführten technischen Zwecke aufgezeigt werden.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Arbeiten zur Entdeckung sekretorischer Peptidasen, ?-1,3-Glucanasen und Peroxidasen aus Basidiomyceten umfassten zunächst ein Screening in Emers- und Submerskulturen. Die Induktion erfolgte durch Zugabe von Cinerean (ein ?-1,3-Glucan aus Botrytis cinerea), von prolinhaltigen Proteinen bzw. von Anthocyanen zum jeweiligen Fermentationsmedium. Eine so identifizierte prolinspezifische Peptidase aus Wolfiporia cocos wurde zunächst durch Ionentauschchromatographie und anschließende Gelpermeationschromatographie gereinigt. Das gereinigte Enzym wurde biochemisch charakterisiert, um beurteilen zu können, ob die Eigenschaften den Anforderungen zur Anwendung in der Getränkeindustrie genügen. Eine Glucanase aus Lentinellus cochleatus wurde bezüglich ihrer Aktivität charakterisiert und mit anderen, kommerziell erhältlichen Glucansen, verglichen.


Ergebnisse und Diskussion

Folgende im Projektverlauf generierte Ergebnisse sind besonders hervorzuheben: Im Screening essbarer Basidiomyceten konnten drei der angestrebten Aktivitäten identifiziert werden. So wurde eine Protease mit prolinspezifischer Aktivität aus Wolfiporia cocos, eine ?-1,3-Glucanase aus Lentinellus cochleatus und eine anthocyanentfärbende Aktivität aus Cyathus striatus entdeckt. Die prolinspezifische Peptidase aus W. cocos wurde gereinigt, biochemisch charakterisiert und ihre technische Anwendbarkeit unter-sucht. Dieses Enzym weist im Hinblick auf eine technische Nutzung vielversprechende Eigenschaften auf. So liegen beispielsweise sowohl das Temperaturoptimum mit 40-50 °C als auch das pH-Optimum mit pH 3,5-5,5 in Bereichen, die das Enzym für einen Einsatz in der Getränkeindustrie prädestinieren. Auch weist das Enzym die für industrielle Anwendungen notwendige Stabilität auf (ca. 80 % Restaktivität nach 6 Monaten Lagerung). Das Substratspektrum reicht von kleinen prolinhaltigen Peptiden über Prola-mine verschiedenen Ursprungs (Reis, Weizen, Gerste, Mais) bis hin zu Casein. Die nächsten Schritte werden darin bestehen, das Enzym im größeren Maßstab zu gewinnen und die Applikation in den ver-schiedenen Bereichen zu konkretisieren. Die ?-1,3-Glucanase aus L. cochleatus weist ihre maximale Ak-tivität bei einem pH-Wert von 3,5 bis 5,5 und einer Temperatur von etwa 65 °C auf. Die chromatographi-sche Analytik, über die sich der Abbau des Glucans über Oligomere bis hin zur Glucose verfolgen lässt, legt nahe, dass sich im Fermentationsüberstand Exo- und Endoglucanase-Aktivitäten überlagern. Eine genauere Einordnung dieser Enzyme wird die noch ausstehende Charakterisierung der gereinigten Enzyme in Folgeprojekten ergeben. In den anwendungstechnischen Versuchen bestätigte sich die Erwartung, dass eine Kombination aus endo- und exo-Glucanase-Aktivität zu einer schnelleren Freisetzung von Glucose führt als der isolierte Einsatz einer der Aktivitäten, nicht. Dies liegt vermutlich darin begründet, dass die verwendete Exoglucanse die generierten kleineren Glucanfragmente weniger gut als Substrat akzeptiert als hochmolekulares Glucan. Detailuntersuchungen hierzu stehen noch aus.
Das gewählte experimentelle Procedere hat sich bewährt, auch wenn die zur Sekretion der Enzyme notwenigen Fermentationszeiten länger als erwartet waren und sich die biochemische Charakterisierung, beispielsweise durch die komplexe Analytik des Glucanabbaus, als arbeitsaufwändiger als erwartet er-wies. Obwohl das geplante Programm dadurch nicht bis ins Detail abgearbeitet werden konnte, wurden wesentliche Fortschritte erzielt. Die wichtigsten Projektziele wurden erreicht, womit der Charakter des Projekts, nämlich das biochemische Potenzial von Basidiomycetenenzymen im Sinne einer Plattformtechnologie aufzuzeigen, erhalten blieb.
Alle Projektpartner stimmen darin überein, dass das Projekt außerordentlich erfolgreich verlief. Die Zusammenarbeit zwischen den Projektpartnern gestaltete sich sehr angenehm, konstruktiv und kooperativ. Die Kooperationspartner standen und stehen in regelmäßigem Kontakt, um Informationen und Ergebnis-se zeitnah auszutauschen.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Bisher wurden keine Ergebnisse publiziert. Die Patentlage im Bereich der prolinspezifischen Protease wird derzeit im Detail geprüft. Eine abschließende Bewertung liegt daher noch nicht vor. Die aktuelle Datenlage lässt Publikationen zur prolinspezifischen Protease ebenso wie zur Glucanase aus Lentinellus cochleatus in peer-reviewed Journals erwarten.


Fazit

Das Projekt konnte die auf den Vorarbeiten der Universität Hannover beruhende Erwartung, dass Basidiomyceten über eine einzigartige Enzymausstattung verfügen, mehr als bestätigen. Die Identifizierung und Charakterisierung der prolinspezifischen Protease aus W. cocos konnte nahezu abgeschlossen werden, so dass die Produktion im größeren Maßstab sowie die Entwicklung von Verfahren zur Anwendung des Enzyms begonnen werden können. Das Anwendungspotenzial der in L. cochleatus identifizierten ?-1,3-Glucanase muss in weiterführenden Versuchsreihen getestet werden. Ob es sich bei dem in Cyathus striatus entdeckten, zur Anthocyanentfärbung befähigten Enzym um ein erfolgversprechendes handelt, muss sich noch zeigen