Projekt 13159/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: Entwicklung eines nachhaltigen Verfahrens zur erstmaligen biokatalysierten Synthese biogener Amide

Projektdurchführung

Dr. André Rieks - Labor für Enzymtechnologie GmbH
Deichstr. 25 a
25436 Uetersen

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Ziel des Projekts ist die Entwicklung eines nachhaltig umweltgerechten und wirtschaftlichen Verfahrens zur enzymatischen Synthese biogener Amide. Die Zielverbindungen können aufgrund ihrer antimikrobiellen, antiinflammatorischen und oberflächenaktiven Eigenschaften sowohl in der Natur- und High-Tech-Kosmetik als auch der pharmazeutischen Industrie eingesetzt werden. Die Verbindungen (hierzu gehören u. a. N-Benzylamide, Ceramide, Anadamid, Oleamid und weitere sekundäre Amide) wurden bislang nicht durch enzymatische Synthesen gewonnen. Die derzeitig praktizierte chemische Synthese ist jedoch hinsichtlich eingesetzter Ausgangsstoffe, notwendiger Reaktionsbedingungen und sich bildender Nebenprodukte mit einer erheblichen Umweltbelastung verbunden. Ein besonderes Problem des chemischen Verfahrens ist die Bildung toxischer N-Nitrosamine. Das geplante biotechnologische Vorhaben, welches modellhaft eine Synthese biogener Amide ohne die genannten Verfahrensnachteile ermöglichen kann, setzt die Bereitstellung spezifischer, im Projekt zu generierender Enzyme voraus.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenIm Rahmen des Projekts wurden im Arbeitsbereich des Projektpartners Universität Greifswald folgende
Methoden angewandt:
- Optimierung eines Hydrolase-Assays für das Amidase-Screening
- Etablierung einer GC/MS-Analytik
- Etablierung einer HPLC-Analytik
- Etablierung einer Kapillarelektrophore-Analytik
- Screening nach Amidase-Aktivitäten
- Entwicklung einer molekularbiologischen Methode mit hoher Mutationsrate
- Einsatz von spiked-Oligonukleotiden für die Kassettenmutagenese
- Etablierung einer Agarplattenmethode zur raschen Analyse der Bibliotheken

Folgende Methoden wurden vom Projektpartner Dr. Rieks GmbH angewandt:
- Chemische Substratsynthese und Aufreinigung
- Etablierung der DC- und HPLC-Analytik (Edukte, Produkte)
- Etablierung der Analytik zur Detektion von Nitrosaminen
- Entwicklung antimikrobieller Assays
- Auswahl antimikrobieller Zielverbindungen
- Durchführung enzymatischer Modellsynthesen


Ergebnisse und Diskussion

Zu Beginn der Projektlaufzeit wurden die Modellsubstrate (biogene Amide) in ausreichenden Quantitäten synthetisiert und die notwendigen Analytiken mittels HPLC, GC und Kapillarelektrophorese etabliert. In enger Absprache zwischen den Projektpartnern Dr. Rieks GmbH und Universität Greifswald konnten alle relevanten Techniken etabliert werden. Muster der Verbindungen wurden von der Dr. Rieks GmbH an die Universität Greifswald übergeben. Beim Projektpartner Dr. Rieks GmbH wurden verschiedene biogene Amide auf antimikrobielle Aktivitäten untersucht. Dabei konnten insbesondere Amide der Zimtsäure, der Ferulasäure, der Kaffeesäure und der Ölsäure als potenzielle Kosmetikwirkstoffe mit breitem antimikrobiellem Potenzial gegen gram-positive und -negative Bakterien, Hefen und Schimmelpilze identifiziert werden. Zimt- und Ferulasäureamide zeigten zusätzlich sehr gute UV absorbierende Eigenschaften.
Im Rahmen eines umfangreichen Screenings wurden vom Projektpartner Universität Greifswald zahlreiche Enzyme auf Aktivität gegenüber den Modellsubstraten in einem im Hause etablierten und im Rahmen der Projektlaufzeit umfangreich optimierten Hydrolase-Assay erfolgreich im Mikrotiterplatten-Maßstab eingesetzt. Da aber keines der Enzyme ausgeprägte Aktivität in der Hydrolyse zeigte und da diese sehr wahrscheinlich nur geringe Syntheseaktivität aufweisen würden, standen diese Fragestellungen für den weiteren Projektverlauf Enzymdesignstudien im Vordergrund.
Leider musste der Kooperationspartner Dr. Rieks GmbH im Oktober 2008 Insolvenz anmelden, so dass von dieser Seite her keinerlei Daten mehr zur Verfügung gestellt wurden, die vorliegenden Daten lagen bereits zum Zeitpunkt des Zwischenberichts vor.
Ein Hochdurchsatz-Assay konnte etabliert werden, ebenso wie die Analytik mittels GC und HPLC. Während einige Enzyme mittelmäßige hydrolytische Aktivität aufwiesen, waren die erzielten Umsätze in der Synthesereaktion leider sehr gering. Nach der Insolvenz des Kooperationspartner Dr. Rieks GmbH rückte dieses Ziel in den Hintergrund, die Arbeit konzentrierte sich auf die Charakterisierung der Bottleneck-Mutanten und die Stützung der praktischen Ergebnisse durch Computer-Docking-Versuche.
Erfolgreich war die Etablierung einer Methode zur fokussierten gerichteten Evolution. Die Methode (genannt One-pot, Simple Methodology for Cassette Randomization and Recombination for Focused Directed Evolution, kurz OSCARR) wurde erfolgreich auf ein Modellenzym angewendet, um zunächst die Kettenlängenspezifität zu verändern. Die mit diesem Verfahren gefundene Mutation enthüllte einen Hotspot am Eingang zum aktiven Zentrum (Bottleneck). Durch rationales Proteindesign konnten weitere Mutanten erstellt werden, die sich in ihren Eigenschaften (Kettenlängenspezifität, Substratspezifität, Enantioselektivität) vom Wildtyp deutlich unterscheiden, so entstanden z. B. Mutanten, die hundertfach aktiver gegenüber p-Nitrophenylpalmitat sind als der Wildtyp, und die 1-Phenyl-1-propylacetat, 1-Phenyl-2-propylacetat und 1-Phenylethylacetat selektiver umsetzen. Durch computergestütztes Docking konnten die Ergebnisse untermauert werden. Durch die herkömmliche Methode der epPCR konnte bei einem Screening einer vergleichbar großen Bibliothek kein Klon mit veränderter Kettenlängenspezifität gefunden werden, unter anderem, da die wichtigen Regionen GC-reich und somit für Mutagenese durch epPCR schwer zugänglich waren. Diese Ergebnisse konnten zum Teil bereits publiziert werden, ein weiteres Manuskript befindet sich in Vorbereitung. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Pseudomonas fluorescens Esterase I Amidaseaktivität besitzt, ein Schnelltest deutet darauf hin, dass sie das industriell interessante Vince Lactam stereoselektiv umsetzt.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Im Rahmen des Projekts wurde an einer Vielzahl von Fachvorträgen auf nationalen und internationalen
Kongressen und Messeveranstaltungen zur Verbreitung der Ergebnisse teilgenommen. Darunter sind
z. B.: Dechema-Workshop Hamburg-Harburg, BIEM Workshop Potsdam, Tagung Greifswald, Workshop
Bremen, Biocat2008, Hamburg.
Die Ergebnisse des Projekts wurden auf internationalen Fachkongressen und in einer internationalen Fachzeitschrift mit Peer-Review-Begutachtung publiziert: Hidalgo, A., Schliessmann, A., Molina, R., Hermoso, J. and Bornscheuer, U.T. (2008): A one-pot, simple methodology for cassette randomisation and recombination for focused directed evolution. Protein Eng. Des. Sel., 21, 567-576.


Fazit

Im Projektverlauf wurden alle relevanten Methoden (Synthese der biogenen Amide und deren Analytik; Mutagenesemethode) etabliert und einige Projektziele erreicht. Erste Untersuchungen zur antimikrobiellen Wirksamkeit der biogenen Amide verliefen sehr Erfolg versprechend. Leider musste der Kooperationspartner Dr. Rieks GmbH im Oktober 2008 Insolvenz anmelden, so dass von dieser Seite her keinerlei Daten mehr zur Verfügung gestellt wurden, die vorliegenden Daten lagen bereits im zum Zeitpunkt des Zwischenberichts vor. Das Ziel der enzymatischen Herstellung biogener Amide wurde nicht in zufrieden stellendem Maße erreicht.