Projekt 13121/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: ICBio: Innovative Aptamer-basierte Proteintestsysteme für medizinische Diagnostik und Katalysatoren für die Entwicklung nachhaltiger Produktionsprozesse

Projektdurchführung

Leibniz Universität Hannover Zentrum für Angewandte Chemie Institut für Technische Chemie
Callinstr. 5
30167 Hannover

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

In diesem Projekt sollen neue Möglichkeiten zur Bereitstellung von Proteinchips für Diagnostik und Proteinscreening dargestellt werden. Das Ziel ist es, zu zeigen, dass Aptamere, die verschiedene relevante Zielmoleküle hochspezifisch und hoch affin in Lösung binden können, auf Chipoberflächen über robuste und universell anwendbare Methoden kovalent und gezielt gekoppelt werden können, dabei ihre Bin-dungseigenschaften beibehalten und für eine schnelle Proteinanalytik einsetzbar sind.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenIn den modernen Biowissenschaften besteht ein steigender Bedarf nach Hochdurchsatzmethoden, die eine schnelle, direkte und quantitative Bestimmung von Proteinen ermöglichen. Die Entwicklung geeigneter Techniken, insbesondere von Protein-Microarrays ist jedoch mit Schwierigkeiten verbunden, die insbesondere mit der Diversität der Proteine zusammenhängen. Aufgrund dieser Nachteile haben sich die Antragsteller das Ziel gesetzt, die Wechselwirkung zwischen Aptameren und Proteinen für die Protein-Mikroarray-Technologie auszunutzen. Aptamere sind hoch affine Nukleinsäuren, die an ihre Targetstruktur mit großer Spezifität und Stärke binden, dabei aber durch ihre biochemische Struktur biologisch abbaubare, nicht toxische Substanzen darstellen. Sie sind ausgezeichnete umweltentlastende und ressourcenschonende hochspezifische Erkennungsmoleküle. Im Projekt werden von der RiNA GmbH zwei bereits entwickelte Aptamere hergestellt und zwei neue Aptamere (gegen Insulin und His-tags) entwickelt und zur Verfügung gestellt. Im TCI werden diese vier Aptamersysteme dann zur Herstellung und Testung von Proteinchips (im Vergleich zu konventionellen Antikörperchips) verwendet. Vivascience ist der Partner in der Chipentwicklung (Membranen, Membranchemie) und der Testkit Entwicklung. In allen Projektstufen ist eine klare Abstimmung unter allen Partnern gewährleistet. Die His-getagten Enzyme (Esterasen und eine Alkoholdehydrogenase) werden vom AK Prof. Bornscheuer hergestellt und zur Verfügung gestellt. In Zusammenarbeit mit der DECHEMA wird eine ökologische Bewertung der Testsysteme für das Screening im Produktionsbereich vorgenommen.


Ergebnisse und Diskussion

Im Rahmen der durchgeführten Arbeiten konnte die Eignung von Aptameren zur Detektion von Proteinen mittels Microarray-Technologie demonstriert werden. Es wurden diverse Versuche zur Funktionalisierung des Microarray-Substrates und Bindungsstudien zwischen Aptamer und Zielmolekül durchgeführt. Ausgehend von aminomodifizierten Oberflächen wurde eine Methode zur Immobilisierung des Aptamers nach Aktivierung mit Cyanurchlorid entwickelt. Zusätzlich wurde eine mit Polyethylenimin modifizierte Oberfläche bereitgestellt, die sterische Hinderungen bei der Faltung des Aptamers minimiert. Bei den Hybridisierungsexperimenten erwies sich sowohl die verwendete Oberfläche als auch die Orientierung des Aptamers auf der Oberfläche von entscheidender Bedeutung für den Erhalt der Funktion des immobilisierten Aptamers. Der aptamerbasierte Microarray wurde optimiert und ein Protokoll zur Durchführung der Microarray-Experimente entwickelt. Die universelle Anwendbarkeit der Oberflächen und des Protokolls wurden durch Versuche mit vier verschiedenen Aptameren bestätigt. Dabei wurden zwei gegen den His-Tag gerichtete Aptamere, ein Aptamer gegen Streptavidin sowie ein Aptamer gegen Daunorubicin verwendet. Somit wurde ein universelles Aptamer-Microarray Testkit geschaffen, mit dem Aptamere unabhängig von ihren Selektionsbedingungen zur Detektion von Proteinen und anderen Substanzen über Microarrays genutzt werden können.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Folgende Beiträge wurden veröffentlicht: 15th Annual Meeting of the German Society for Cytometry 2005: DNA and protein arrays in biotechnology (Vortrag); Statusseminar Chiptechnologien 2007: Entwicklung von aptamerbasierten Protein Microarrays für biotechnologische Anwendungen; BioPerspectives 2007: Aptamers: Alternative Capture Molecules applied to Protein Microarrays sowie zwei Artikel: Nonradioactive fluorescence microtiter plate assay monitoring aptamer selections, Biotechniques, 42 (2007), 578-582 und Semiautomated selection of DNA aptamers using magnetic particle handling Biotechniques, 43 (2007), 344-353. Auf dem Statusseminar Chiptechnologien 2008 wurde folgender Beitrag eingereicht: Application of Aptamers to Protein Microarrays: Systematic Investigation of Immobilization Strategies
Weitere Veröffentlichungen sind in Vorbereitung.


Fazit

Die wissenschaftlichen Arbeiten innerhalb des Projekts sind abgeschlossen. Die Bereitstellung geeigneter modifizierter Oberflächen sowie Studien zur Immobilisierung verschiedener Aptamere konnten erfolgreich abgeschlossen werden. Es wurden aptamerbasierte Microarrays zur Detektion von His-getagten Proteinen, Streptavidin sowie Daunomycin entwickelt. Dabei konnten medizinisch relevante Konzentrationen detektiert werden