Projekt 13120/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: ICBio: Modularer Mikro-Hohlfaserreaktor zur maßgeschneiderten Proteinabtrennung in Zellkulturtechnik

Projektdurchführung

Leibniz Universität Hannover Zentrum für Angewandte Chemie Institut für Technische Chemie
Callinstr. 5
30167 Hannover

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Ein zukunftsweisender Ansatz für die Durchführung von kontinuierlichen und integrierten biotechnologischen Verfahren ist die Einbindung von Hohlfasermodulen in den Produktionsprozess. Diese sind in der Lage, auf einfache Weise die Abtrennung von Produkten oder die Rückhaltung von Verfahrensbestandteilen, wie Zellen oder immobilisierten Biokatalysatoren zu ermöglichen. Ferner lassen sich modifizierte und gezielt funktionalisierte Hohlfasern für die hochaffine Bindung von Metaboliten nutzen. Dies lässt sich für die Isolierung von Wertstoffkomponenten, zur Entfernung qualitätsmindernder Bestandteile und zur Aufreinigung von Rohprodukten ausnutzen. So können integrierte Produktionsabläufe aufgebaut werden, deren ökonomische und ökologische Bilanz durch Ressourcenschonung, durch Verringerung der Produktkontamination, durch Energieeinsparung und durch Minderung der Reststofffrachten im Vergleich zu herkömmlichen Produktionsprozessen erheblich verbessert wird.
Ziel des Projekts ist die Entwicklung funktionalisierter Hohlfasermodule auf Basis der Mikrohohlfaserkassetten für die Bereiche Kultivierung und Downstreaming, um integrierte Prozessabläufe zu ermöglichen, sowie deren Testung und Etablierung an Modellsystemen.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenHerstellung von funktionalisierten Hohlfasermodulen mit den Arbeitsschritten Modifikation der Basismembranen, Immobilisierung von Ligandensystemen und Charakterisierung der Module. Testung, Optimierung und Einsatz der Module an Modellsystemen in den Bereichen Kultivierung und Downstreaming. Modellierung und Aufbau der modularisierten Systeme zur Etablierung integrierter Prozessabläufe.


Ergebnisse und Diskussion

Im Rahmen der durchgeführten Arbeiten konnte aufgezeigt werden, dass fertige Hohlfasermembranen aus PES oder PS gezielt modifiziert werden können. Ausgehend von der epoxyaktivierten Hohlfaseroberfläche besteht die Möglichkeit, verschiedene funktionelle Gruppen auf die Membran aufzubringen. Neben der Herstellung von Ionenaustauscher-Membranen (S, C, Q, D) können auch Metalle, die an eine mit IDA modifizierte Membran angebunden werden, auf die Hohlfaser aufgebracht werden. Die Beladungsdichten der entsprechenden Gruppen pro g Hohlfaser liegen im unteren µmol-Bereich. Modifizierte Membranmaterialien weisen keine Beeinträchtigung der Porenstruktur auf, so dass sie im Bereich der Kultivierung und des Downstreamings eingesetzt werden können.
Die umfangreichen Arbeiten hinsichtlich Weiterentwicklung bzw. letztlich sogar einer vollständigen Neukonstruktion des Mikrohohlfaserreaktors (MHFR) des Partners Saxonia ermöglichten den Aufbau eines differenzierten Reaktorsystems, das z. B. durch Integration eines Rührers, zusätzlicher Hohlfasermembranlagen für eine O2-Begasung oder den Einbau einer faseroptischen online-Analytik erfolgreich im Anwendungsbereich Zellkultivierung eingesetzt werden kann. Um kontaminationsfreies Arbeiten zu gewährleisten, wurde ein umfangreiches Screening von Sterilisationsmethoden durchgeführt und ein geeignetes Sterilisationsprotokoll erarbeitet. Zudem wurde ein Integritätstest zur Überprüfung der Funktionsfähigkeit der Hohlfasermembranen im Modul etabliert. Das MHFR-System wurde während der Arbeiten in Bezug auf das Verweilzeit-, Mischungs- und Strömungsverhalten u. a. reaktionstechnisch charakterisiert, um die Weiterentwicklung des Reaktorsystems zu überprüfen und um grundlegende technische Daten zu erarbeiten. Die Etablierung des MHFR-Systems im Bereich Zellkultivierung wurde anhand der Kultivierung einer Auswahl verschiedener Produktionsorganismen, wie Corynebacterium glutamicum, Bacillus megaterium und Escherichia coli durchgeführt und der klassischen batch-Kultivierung im Schüttelkolben gegenübergestellt. Der Einsatz der miniaturisierten Hohlfasermodule eignet sich besonders, um integrierte Prozessabläufe zu realisieren. Ein Arbeitsbereich war die durch die entsprechenden E.coli- und B.megaterium-Stämme produzierten His-tag-Proteine effizient über die mit Metall modifizierten Hohlfa-sern aufzureinigen und zu isolieren.
Insgesamt betrachtet ist der MHFR im Bereich biotechnologischer Prozesse vielfältig einsetzbar. Sowohl im Bereich Kultivierung als auch im Bereich Downstreaming erfahren die Hohlfasermodule eine Anwendung. Durch die Miniaturisierung des Reaktors kommt es zu einer erheblichen Energieeinsparung und Umweltentlastung. Mittels Kombination einzelner Hohlfasermodule zur Anordnung von Kaskaden oder Flächen ergibt sich ein geeignetes System für Screeninganalysen.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

DECHEMA-Jahrestagung der Biotechnologen 2006: Heterogeneous surface modification of hollow fiber membranes and application to integrated downstream processes (Vortrag) und Processing of a hollow fiber micro-bioreactor for applications in cultivation and downstreaming (Poster); European Symposium on Biochemical Engineering Science (ESBES): Applications for novel hollow fiber micro-bioreactor in cultivation and downstreaming (Vortrag) und Heterogeneous surface modification of hollow fiber membranes and the utilization of affinity membranes in purification processes (Poster). Zudem sind folgende Beiträge in Veröffentlichung: Development and characterization of a novel hollow fiber micro-bioreactor for cultivation of microorganisms (Journal of Biotechnology) und Heterogeneous surface modification of single hollow fiber membranes and novel hollow fiber micro-bioreactor (Journal of Membrane Science).


Fazit

Durch die Aufnahme neuer Arbeitspakete wie die Weiterentwicklung bzw. vollständige Neukonstruktion des MHFRs, die den erfolgreichen Einsatz des Reaktors im Bereich Kultivierung erst ermöglicht haben, konnten die Arbeiten zum weiterführenden Arbeitspaket 7 (Anwendungsbereich Wirkstofftestung) im Rahmen der Projektlaufzeit nicht abschließend bearbeitet werden. Arbeitspakete zur Modifikation der Basismembran zur Anbindung von Liganden sowie der Aufbau und Charakterisierung der funktionalisierten Hohlfasermodule sind vollständig abgeschlossen. Eine Vielzahl verschiedener Oberflächenfunktionalitä-ten der Hohlfasermembranen wurde generiert und an verschiedenen Targetmolekülen, die von den entsprechenden Mikroorganismen produziert werden, getestet. Weitere Arbeitspakete im Bereich Kultivierung und Downstreaming sind in den letzten Monaten intensiv bearbeitet worden und zeigen vielversprechende Ergebnisse. So liegen nun optimierte MHFR vor, die ein großes Potential für vielfältige Anwendungen zeigen. Durch die ständige Weiterentwicklung des MHFRs konnte die erfolgreiche Kultivierung verschiedenster Mikroorganismen gewährleistet werden.
Des Weiteren sind Strategien zur Aufreinigung und zum Nachweis der entsprechenden Produkte etabliert worden. Durch Kombination dieser beiden Arbeitsaspekte konnte die Option eines integrierten Downstream-Processings erarbeitet werden.