Projekt 13107/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: ICBio: Einsatz von Amidasen aus extremophilen Mikroorganismen für die enantioselektive Synthese von Amino- und Carbonsäuren

Projektdurchführung

Technische Universität Hamburg CBBS Center for Biobased Solutions
Kasernenstr. 12
21073 Hamburg

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Biokatalysatoren - Enzyme oder Mikroorganismen - werden in der Zukunft eine Schlüsselrolle bei der Herstellung wertvoller Verbindungen für die chemische und pharmazeutische Industrie spielen. Insbesondere bei der Synthese chiraler Verbindungen haben Biokatalysatoren ein großes Potenzial. Im Sinne einer integrierten Produktionsweise ist daher die biokatalytische Synthese von enantiomerenreinen Wirkstoffen von Vorteil, weil nur so die kostenintensive Enantiomerentrennung vermieden werden kann. Ziel des vorliegenden Vorhabens war die umweltfreundliche Gewinnung von Amino- und Carbonsäuren aus Amiden durch den Einsatz neu entdeckter Amidasen aus extremophilen Mikroorganismen. Im Gegensatz zu den bereits beschriebenen Amidasen zeichnen sich die Enzyme aus extremophilen Mikroorganismen durch eine hohe Stabilität gegenüber hohen Temperaturen und anderen denaturierenden Einflüssen aus. Darüber hinaus verfügen die neu entdeckten Amidasen über breite pH-Spektren, die insbesondere auch den sauren und neutralen Bereich abdecken.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenIm Rahmen des Projekts wurden zwei Amidasen aus thermophilen Actinomyceten aufgereinigt und vollständig charakterisiert. Die Enzyme aus Thermocrispum municipale 4K und Pseudonocardia thermophila zeichnen sich durch hohe Thermoaktivität und -stabilität aus und verfügen über ein breites Substratspektrum. Diese Eigenschaften machen sie interessant für eine industrielle Anwendung. Im Rahmen der molekularbiologischen Arbeiten in diesem Projekt konnte die Gensequenz der Amidase aus Pseudonocardia thermophila aufgeklärt werden. Darüber hinaus wurden weitere Amidasegene aus extremophilen Mikroorganismen kloniert und in mesophilen Wirtszellen exprimiert.
Methoden:
o aerobe Kultivierungstechnik
o Proteinaufreinigung mittels verschiedener chromatographischer Methoden
o HPLC-Untersuchungen zur Charakterisierung von Enzymen
o Isolierung der genomischen DNA mittels CTAB-Methode
o Klonierung von Amidase kodierenden Sequenzen
o Konstruktion einer DNA-GenBank Bibliothek
o Screening der GenBank auf Substrat-Platten
o Inverse pCR
o Polyacrylamid Gel Elektrophorese
o Enzymatischer Nachweis der aktiven Proteine in Gelen
o Expression rekombinanter Proteine


Ergebnisse und Diskussion

Die nativen Amidasen aus Thermocrispum municipale 4K und Pseudonocardia thermophila wurden planmäßig gereinigt und vollständig charakterisiert. Beide Enzyme sind sehr thermoaktiv und zeigen maximale Aktivität bei 70°C. Die Amidase aus T. municipale 4K weist darüber hinaus ein ungewöhnlich breites pH-Profil auf. Beide themoaktiven Amidasen verfügen über ein breites Substratspektrum und sind sehr resistent gegenüber Detergenzien und Reduktionsmitteln. Aufgrund dieser Eigenschaften verfügen beide Enzyme über ein großes Potenzial für eine industrielle Anwendung zur Herstellung von Carbonsäuren und ungewöhnlichen Aminosäuren.
Im Laufe des Projekts konnten wie geplant zahlreiche Amidasegene aus extremophilen Mikroorganismen kloniert werden. Ziel war es, eine möglichst große Anzahl von Amidasen mit unterschiedlichen Eigenschaften für eine industrielle Nutzung zu erschließen. Die Klonierung von Amidasegenen aus A. gottschalkii, M. jannaschii, M. thermoautotrophicus, Aquifex aeolicus und T. maritima konnte erfolgreich durchgeführt werden. Da die rekombinaten Amidasen in Form von unlöslichen inclusion bodies vorlagen, mussten unerwartet große Anstrengungen unternommen werden, um Lösungsansätze für diese Fragestellungen zu entwickeln. Anders als ursprünglich geplant sind daher neben den Standard-Expressionssystemen (E. coli BL21) noch weitere Systeme getestet worden mit dem Ziel, die Bildung von inclusion bodies zu vermeiden bzw. signifikant zu reduzieren. Durch Fusion der Amidase mit verschiedenen colour tag Proteinen (CTP), die in E. coli sehr gut löslich sind, wurde die Löslichkeit der rekombinaten Amidase verbessert. In weiteren Untersuchungen sollen die löslichen rekombinanten Proteine nun charakterisiert und mit verschiedenen Substraten getestet werden.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Egorova, K., H. Trauthwein, S. Verseck, G. Antranikian. 2004. Purification and properties of an enantioselective and thermoactive amidase from the thermophilic actinomycete Pseudonocardia thermophila. Appl. Microbiol.&Biotechnol. 65, 1:38-45.

Egorova, K., H. Trauthwein, G. Antranikian. 2004. A rapid and sensitive method for the detection of amidases in polyacrylamide gels and agar plates. J. Microb. Methods submitted.

Egorova K., P. Müller, C. Vorgias, H. Trauthwein, S. Verseck, G. Antranikian. Thermophiles as sources of thermostable nitrile-degrading enzymes. International Congress on Biocatalysis, 29.08.-01.09.2004, Hamburg, Germany. P. 250.

Egorova, K., H. Trauthwein, S. Verseck, G. Antranikian. The amidase from Pseudonocardia thermophila. German Patent. 21.03.2003. Submission number DE 103 12 842.

Egorova, K., H. Trauthwein, G. Antranikian. A method for the detection of amidases in polyacrylamide gels and agar plates. German Patent. 2002. Submission number 10233686.5.


Fazit

Die Zusammenarbeit innerhalb des Projektkonsortiums verlief ausgezeichnet und sehr vertrauensvoll. Die Expertisen der Projektpartner ergänzen sich sehr gut. Schwerpunkte lagen bei der AG Antranikian in der Bereitstellung extremophiler Mikroorganismen und in der Klonierung von Amidasegenen. Die molekularbiologische Seite wurde durch den Projektpartner X-Zyme GmbH hervorragend ergänzt. Mit dem Industriepartner Degussa AG wurden mögliche Strategien zur Umklonierung der Amidasen in ein industrielles Expressionssystem erarbeitet.