Projekt 13095/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: ICBio: Entwicklung eines nachhaltigen Verfahrens zur prozessintegrierten rekombinanten Biokatalyse für hochselektive Epoxidierungen

Projektdurchführung

Gesellschaft für umweltkompatible Prozesstechnik mbH
Im Stadtwald, Geb. 47
66123 Saarbrücken
Telefon: 0681/9345-0

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Traditionelle chemische Verfahren für stereoselektive Epoxidierungen oder Hydroxylierungen basieren auf Schwermetallkatalysatoren. Biokatalytische Oxygenierung stellt daher eine ökonomisch sowie ökologisch interessante Alternative dar. Entsprechende Biokatalysatoren sind jedoch stark limitiert durch Substrat- und Produktinhibition. Dies erfordert eine integrierte, effektive und kostengünstige Abtrennung von Produkten aus Reaktionsgemischen. Der bisherige Emulsionsprozess zur stereospezifischen Styrolepo-xidierung erlaubt dies nur in nicht kontinuierlicher Betriebsweise. Aus ökonomischen sowie ökologischen Gründen erfordert die industrielle Anwendung aber zumindest eine halbkontinuierliche Prozessführung sowie hohe Produktivität. Dies wird durch effektive Rückextraktion der Produkte aus der Emulsion (innovative Membran- und scCO2-technologien) sowie durch hohe Aktivität und Langzeitstabilität des Biokatalysators (in vivo Kofaktorregenerierung, Enzymstabilität) angestrebt.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenFür Biotransformationen im Zweiphasensystem mit Bis-(2-ethylhexyl)phthalat als organischer Phase wurden wachsende sowie ruhende (nicht wachsende) rekombinante, Styrolmonooxygenase (StyAB) exprimierende E. coli eingesetzt. Diese wurden in kontinuierlicher Kultur sowie im Satz- und Zulaufverfahren kultiviert. Aktivitätsbestimmungen fanden in rein wässrigem Puffer mit ruhenden Zellen oder Zellextrakt statt. Zur Erhöhung des Reduktasegehalts wurde eine zweite Kopie des Reduktasegens (styB) in den Expressionsvektor kloniert. Für die Begasung wurden hochporöse keramische Rohr- und Hohlfasermembranen sowie Membranmodule entwickelt. Dafür wurde die Beständigkeit der Einklebungen der Membranen untersucht. Die Porengrößenverteilungen wurde mittels Bubble-point und Flow-pore Methode bestimmt. Zum Einsatz in Extraktionsmodulen wurden keramische Hohlfasermembranen mit selektiven Polymeren (PDMS, Teflon) beschichtet. Die Membranen wurden mittels REM-Aufnahmen und Gasselektivitätstests sowie über Flussbestimmungen charakterisiert und kontrolliert. Um die Möglichkeit der Produktextraktion mit überkritischem CO2 aus BEHP oder der Emulsion zu evaluieren, wurden sowohl SFE (Supercritical Fluid Extraction) als auch SFC (Supercritical Fluid Chromatography) eingesetzt.


Ergebnisse und Diskussion

Oxygenasen katalysieren unter milden Bedingungen industriell interessante hoch spezifische Oxyfunktionalisierungen. Limitationen finden sich häufig in den Bereichen Substrat- und Produktinhibition, Sauerstofftransfer, Enzymstabilität, und Kofaktorregeneration. Hier wird die Charakterisierung und Optimierung eines Emulsionsprozesses zur enantioselektiven Styrolepoxidierung, die auf Styrolmonooxygenase enthaltenden rekombinanten E. coli beruht, beschrieben. Bis-(2-ethylhexyl)phthalat (BEHP) wurde dabei als organische Phase zur Produktextraktion benutzt. Für die Prozessführung wurden kontinuierliche Kultivation inklusive Metabolismusbetrachtungen und das Zulaufverfahren evaluiert, wobei NADH-Limitation bzw. Produkttoxizität als Hauptlimitationen gefunden wurden. Basierend auf dem Zulaufverfahren wurde ein semikontinuierliches repeated fed-batch-Verfahren mit einer durchschnittlichen Produktivität von 5.3 g/Ltot/h entwickelt. Durch Erhöhung der Reduktaseexpression und Untersuchungen mit wachsenden wie auch nicht wachsenden, ruhenden Zellen im Ein- und Zweiphasensystem wurde gefunden, dass weder Massentransfer noch intrinsische Enzymstabilität limitierend waren, obwohl sich die Reduktase als relativ instabil erwies. Die zeitliche Abnahme der spezifischen Aktivität ruhender Zellen war ebenfalls aber nicht ausschließlich durch Produktinhibition bedingt. Zur Produktabtrennung aus der Emulsion und Begasung wurden lösungsmittelbeständige Membranen und Membranmodule entwickelt. Diesbezüglich stehen nun keramische Hohlfasermembranen mit unterschiedlichen Porenweiten (20 nm bis 1400 nm) und dampfsterilisierbare Module aus Edelstahl mit austauschbaren Membranelementen (Fläche 0.05 m² bis 5 m²) zur Verfügung. Alternativ können die Membranen neuerdings auch vollkeramisch ausgeführt werden. Für die Begasung erwiesen sich die Hohlfasermembranen als sehr effizient und ermöglichten eine bis zu 13-fache Steigerung des Saustoffeintrags - einer Hauptlimitation beim Scale-Up. Für die selektive Produktabtrennung wurden die keramischen Hohlfasermembranen mit Polydimethylsiloxan (PDMS) sowie einem perfluorierten Polymer (Teflon) beschichtet. Erstere war besser geeignet für die Pervaporation, letztere für die Pertraktion. Trotz viel versprechender Resultate konnten die für den Bioprozess benötigten Produktextraktionsraten noch nicht erreicht werden. Für die in Zukunft angestrebte Optimierung der Membranmodule bieten vor allem Supportunterstruktur und Beschichtung der Membranen sowie eine Vergrö-ßerung der Membranfläche großes Potenzial. Derartige Konzepte für lösemittelbeständige Membranen, die für Pertraktion wie auch Pervaporation genutzt werden können, sind bisher unbekannt und stellen ei-ne viel versprechende innovative Neuentwicklung dar. Trennversuche mit einem modifizierten SFE-Verfahren (Extraktion mit scCO2) bei variablen Drücken und Temperaturen zeigten, dass Styrol und Styroloxid problemlos aus BEHP sowie der Emulsion extrahiert werden können. Des Weiteren konnten Styrol und Styroloxid mittels Chromatographie mit scCO2 (SFC) und Kieselgel-basierter Festphase vonein-ander getrennt werden. In Zukunft soll die Kopplung von Biotransformation, Membrantechnologie und scCO2-Technologie die Produktion von chiralen Epoxiden in einem nachhaltigen integrierten Prozess er-lauben.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Innerhalb des Projekts generierte Toxizitätsdaten sind in einen wissenschaftlichen Artikel eingeflossen, der an die Zeitschrift Applied and Environmental Microbiology geschickt wurde. Eine weitere Publikation über Metabolismusbetrachtungen bei katalytisch aktiven Zellen ist in Arbeit. Bezüglich den Eigenschaften ruhender Zellen sowie der Begasung und Produktextraktion über keramische Membranen sind weitere Publikationen in Fachzeitschriften geplant. Über limitierende Faktoren in der oxidativen Biokatalyse mit wachsenden wie auch ruhenden Zellen im Zweiphasensystem wurde in Manchester (Biocatalysis in non-conventional media; 13./14.4.05) eine Präsentation mit dem Titel Whole-Cell Bio-oxidationin a Two-Liquid Phase System. What are the Limiting Factors? gegeben.


Fazit

Im Rahmen des Projekts wurde ein semikontinuierliches Verfahren zur biokatalytischen Epoxidation von Styrol zu (S)-Styroloxid entwickelt und optimiert, wobei hohe Produktivitäten erreicht wurden. Biokatalysator-Engineering sowie der Einsatz ruhender Zellen ergaben interessante Einblicke in Massentransfer, Biokatalysatoraktivität und -stabilität sowie Produktinhibition. Um die Hauptlimitationen Produkttoxizität und - auf technischem Maßstab - Sauerstofftransfer zu umgehen, wurden keramische Membranen und Membranmodule entwickelt. Die Begasungseffizienz konnte mittels Keramikmembranen bis um das 13-Fache gesteigert werden. Stofftransportuntersuchungen ergaben, dass vor allem die mit Pertraktion aber auch die mit Pervaporation erreichten Produktextraktionsraten noch zu niedrig waren, um die Verfahren erfolgreich an die Biotransformation zu koppeln. Zudem wurde gezeigt, dass Styroloxid mit Trenntechnologien in überkritischem CO2 effizient aus BEHP extrahiert und aufkonzentriert werden kann. In einem weiteren von der DBU finanzierten auf den vorliegenden Ergebnissen aufbauenden Projekt soll das hier erkannte hohe Entwicklungspotenzial der Membran- und scCO2-technologien ausgenutzt und die Bioka-talyse über 13C-Flussanalyse charakterisiert werden. Dies wird die Entwicklung nachhaltiger Bio-Oxyfunktionalisierungsprozesse erlauben.