Projekt 13076/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: ICBio: Entwicklung innovativer Mikrotiterplattenreaktoren zur Bewertung des Abbaus und der Toxizität neuer Wirkstoffe auf Basis von Mikrosomen und Säugerzellen

Projektdurchführung

Universität des SaarlandesLehrstuhl für Technische Biochemie
Campus A 1.5
66123 Saarbrücken

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Täglich werden neue Wirkstoffe und Chemikalien für die Förderung der Gesundheit bzw. Bekämpfung von Krankheiten und die Befriedigung verschiedenster anderer menschlicher Bedürfnisse entwickelt und neu in den Verkehr gebracht. Jeder dieser Stoffe bringt aber auch ein mehr oder weniger großes Gesundheits- und Umweltrisiko mit sich. Aus diesem Grund gibt es ein breites Spektrum von Methoden, mit denen erwünschte und unerwünschte Wirkungen von Wirkstoffen und Chemikalien und deren Metabolismus untersucht werden. In vielen Bereichen müssen für derartige Untersuchungen immer noch umstrit-tene Tierversuche durchgeführt werden. Sehr frühe und kostengünstige Studien vermindern Entwicklungsrisiken ökonomischer, ökologischer und sozialer Art. Im vorliegenden Projekt werden Mikrotiterplattenreaktoren mit integrierten optischen Sensoren für Sauerstoff sowie auf Respirationsmessungen beruhende Methoden zur Untersuchung des Metabolismus und der Toxizität von Wirkstoffen entwickelt.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Firmen Microcoat und PreSens entwickelten 96er Mikrotiterplatten mit integrierter Sauerstoffmessung, die auch zur Kultivierung adhärenter Säugerzellen geeignet sind. Hierzu wurden bei PreSens geeignete Sensormaterialien für zellkulturkompatible Sensoren entwickelt. Microcoat erarbeitete Beschichtungstechniken für den Sensor und für die Kompatibilität mit den Säugerzellen. In der Technischen Biochemie der Universität des Saarlandes wurden Methoden zur Bestimmung der Respirationsraten entwickelt. Dies geschah unter Zuhilfenahme von mathematischer Modellierung und Simulation. Across Barriers und Pharmacelsus beschäftigten sich vor allem mit der Untersuchung des Metabolismus von Wirk-stoffen. Dabei wurden von Across Barriers isolierte Mikrosomen mit entsprechenden Cytochromen P450 eingesetzt. Pharmacelsus konnte eine Methode zur online Bestimmung der Lebensfähigkeit von Hepatocyten entwickeln, die dann für die Untersuchung des Wirkstoffabbaus eingesetzt wurde. So konnten cyto-toxische Effekte neuer Wirkstoffe schnell und einfach bestimmt werden.


Ergebnisse und Diskussion

Für ein neues Verfahren zur Messung der Sauerstoffkonzentration während der Kultivierung von Zellen wurden chemisch-optische Sauerstoffsensoren für 96-well Mikrotiterplatten (MTP) mit Flachboden entwi-ckelt, die dann als Mikroreaktoren eingesetzt werden. Besonderes Augenmerk lag auf den Haftungseigenschaften der Sensorschichten in den verwendeten MTP, der Möglichkeit von Sekundärbeschichtungen sowie der Unempfindlichkeit der Messmethodik auf Störeinflüsse durch andere Medienkomponenten und Zellen.
Diese MTP konnten in diesem Projekt erfolgreich zur Kultivierung proliferierender adhärenter Säugerzellen eingesetzt werden. Ohne zusätzliche Sekundärbeschichtung konnte der Sauerstoffverbrauch sowohl von humanen Coloncarcinomzellen (Caco2) als auch von humanen embryonalen Nierenzellen quantifiziert werden. Die Menge des verbrauchten Sauerstoffs war dabei proportional zur eingesäten Zellzahl. Eine zusätzliche Beschichtung der Sensorplatten mit Collagen ermöglichte die Kultur primärer Hepatozyten aus der Ratte. Auch hier war die Sauerstoffkonzentration in der Platte abhängig von der eingesetzten Zellzahl, allerdings verschieden von Caco2, da primäre Hepatozyten nicht zur Zellteilung in der Lage sind. Die neuen MTP konnten in Cytotoxizitätsassays mit bekannten Referenzsubstanzen eingesetzt werden und lieferten LC50-Werte, die gut mit der Literatur übereinstimmen. Diese Experimente zeigten, dass die Messung des Sauerstoffverbrauchs die konventionelle Lebensfähigkeitsbestimmung in der Zellkultur er-setzen kann.
Auch bei Suspensionszelllinien wie CHO, die weit verbreitet in der Produktion therapeutischer Proteine sind, ist die in den Mikrotiterplatten gemessene Sauerstoff-Aufnahmerate ein gutes Maß für die Lebensfähigkeit der Zellen zur Bestimmung der Toxizität von Substanzen und für die Optimierung von Nährmedien.
Mit den neuen MTP wurde der metabolische Arzneistoffabbau unter Einsatz von Mikrosomen mit Cytochrom P450 verfolgt, wobei der Sauerstoffverbrauch bei der Oxidation von Xenobiotika über das P450 System (Monooxygenaseaktivität) vermessen wurde. Mit gepoolten Lebermikrosomen treten im Gegensatz zu isoliertem Cyp3A4 unspezifische Nebenreaktionen auf, die eine Versuchsauswertung erschweren. Als Modellarzneistoffe wurden Verapamil und Testosteron überprüft.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

- Heinzle, E., Deshpande, R. Bock, U., John, G., Krause, C., Müller, G., Waltenberger, H., Maas, R. (2003): Entwicklung von innovativen Mikrotiterplattenreaktoren zur Bewertung des Abbaus und der Toxizität neuer Wirkstoffe auf Basis von Mikrosomen und Säugerzellen. transkript Sonderband Bio-katalyse, 66-67.
- Deshpande, R.R., Heinzle, E. (2004): Animal Cell Culture Using Microplates with Integrated Oxygen Sensors: Oxygen Uptake Rate and Cell Viability. Biotechnol. Lett., 26:763-767.
- Deshpande, R.R., Wittmann, C., Heinzle, E. (2004): Microplates with integrated oxygen sensing for medium optimization in animal cell culture. Cytotechnol. 46:1-8.
- Deshpande, R.R., Kirsch, Y., Maas, R., John, G.T., Krause, C., Heinzle, E. (2005): Microplates with Integrated Oxygen Sensors for Kinetic Cell Respiration Measurement and Cytotoxicity Testing in Primary and Secondary Cell Lines. ASSAY Drug Devel. Technol. 3: 299-307.
- Deshpande, R.R., John, G., Heinzle, E. (2003): Cultivation and Oxygen Uptake Rate of CHO Cells in Microtitre Plates with Integrated Dissolved Oxygen Sensing. Poster am 11th European Congress on Biotechnology, Basel, Switzerland - 24-29.08.2003
Das Projekt wurde auf dem DBU-Stand der Biotechnica 2003 mit einem Poster und mit einem Flyer präsentiert.


Fazit

In der hier vorliegenden Studie ist es erstmals gelungen, eine 96-well-O2-Sensorplatte mit Flachboden zu entwickeln, welche zur Kultur adhärenter Zellen geeignet ist. Sowohl Zelllinien als auch primäre Zellen können auf der Platte kultiviert werden und zur Sauerstoffmessung herangezogen werden. Die Sauerstoffmessung liefert Daten über die Lebensfähigkeit der kultivierten Zellen und kann zur Bestimmung der Toxizität neuer Wirkstoffe eingesetzt werden. Die erhaltenen Sauerstoffdaten während der Kultur der proliferierenden Zelllinien korrelieren gut mit Daten, die mit einem konventionellen MTT-Test erhalten wurden und können somit zur Bestimmung der Lebensfähigkeit verschiedener Zellen herangezogen werden. Die in dieser Studie erstmals etablierte Kultur adhärenter Zellen auf O2-Sensorplatten erlaubt auch die Bestimmung der Toxizität neuer Wirkstoffe auf unterschiedlichste Zelltypen. Über die ursprünglich vorge-sehenen Arbeiten hinaus wurde eine Medienoptimierungen für CHO in MTP erfolgreich durchgeführt. Die Sauerstoffmessung zum metabolischen Abbau von Substraten in MT-Platten mit Sauerstoffsensor zeigte für gepoolte Mikrosomen eine Machbarkeit der Verfolgung der Abbaureaktionen. Gleichzeitig traten auf-grund der unkontrollierten Nebenreaktionen viele Störfaktoren auf. Erste orientierende Studien mit isolierten Cyps (z. B. Cyp3A4) deuten auf eine Lösung unter dem Aspekt der Störfaktoren/Nebenreaktionen hin.