Projekt 13066/01

örderschwerpunkt Biotechnologie: Entwicklung innovativer und selektiver Glykosyltransferase-Assays zum gezielten Screening einer Vielzahl von Mikroorganismen zur Produktion industriell relevanter Glykosyltransferasen für die Lebensmittel- und Pharma[…]

Projektdurchführung

Universität Hohenheim Institut für Lebensmitteltechnologie Lehrstuhl Biotechnologie
Garbenstr. 25
70593 Stuttgart

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Ziel des Projekts ist es, die effiziente enzymatische Produktion sowohl bereits bekannter als auch neuartiger Oligo- und Polysaccharide sowie funktioneller Fructoside mittels neuer Glykosyltransferasen des Nicht-Leloir-Typs zu ermöglichen. Ausgangssubstrat für diese Enzyme ist die aus nachwachsenden Roh-stoffen in großer Menge vorhandene Saccharose. Diese neuen Glykosyltransferasen können dann ge-zielt zur ressourcenschonenden enzymatischen Herstellung neuartiger Oligosaccharide und Zuckerderivate in der Lebensmittel- und Pharmaindustrie eingesetzt werden.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenAusgehend von literaturbekannten Glykosyltransferasenproduzenten (Acetobacter diazotrophicus, Rahnella aquatilis), die als Positivkontrollen zur Entwicklung eines selektiven Fructosyltransferase-Assays dienen, wurde ein spektrophotometrischer Assay zum schnellen, qualitativen, direkten Nachweis gebildeter Oligo- und/oder Polysaccharide im Mikrotiterplattenformat entwickelt. Mittels dieses Assays wurden verschiedene Habitate (diverse Böden, pflanzliches Material) auf Mikroorganismen mit Fructosyltransferaseaktivität hin gescreent. Um ein Vergleichsenzym aus Rahnella aquatilis verfügbar zu machen, wurde das Levansucrasegen heterolog in Escherichia coli exprimiert. Aus dem Screening wurde Gluconobacter cerinus als neuer Fructosyltransferaseproduzent ausgewählt und im 4 L-Maßstab kultiviert.


Ergebnisse und Diskussion

Bei der Kultivierung von Rahnella aquatilis im 10 L-Maßstab konnte die Biomasseausbeute im Vergleich zur Literatur (Ohtsuka, et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56 (9), 1992) um den Faktor 33 gesteigert wer-den. Die von Ohtsuka et al. (1992) angegebenen Aktivitäten konnten nicht reproduziert werden. Es wur-den lediglich 5 % der von Ohtsuka et al. (1992) erzielten Aktivität erhalten. Es zeigte sich bei der Kultivie-rung, dass durch die Bildung von Levan die Gewinnung der Biomasse und die nachfolgende Gewinnung und Aufreinigung der Levansucrase so erschwert wurden, dass dieser Ansatz nicht weiter verfolgt wurde.
Um das Referenzenzym für weitergehende Untersuchungen zur Verfügung zu stellen, wurde das Levansucrasegen heterolog in Escherichia coli exprimiert. Zur Erleichterung der Aufreinigung wurde ein His-Tag angefügt. Es wurden 52 µkat Fructosyltransferaseaktivität1 aus 1,9 g Biotrockenmasse erhalten. Die Aufreinigung erfolgte mittels Nickelchelataffinitätschromatographie. Die Aktivitätsausbeute betrug 90 %, der Aufreinigungsfaktor 21.
323 Stämme aus verschiedenen Habitaten waren auf Fructosyltransferaseaktivität hin gescreent worden. 27 wurden als Fructosyltransferaseproduzenten identifiziert. Für weitere Untersuchungen wurde daraus Gluconobacter cerinus ausgewählt. Gluconobacter cerinus wurde im 4 L-Maßstab zur Gewinnung der Levansucrase kultiviert. Dabei wurden bei der Kultivierung mit 50 g Mannit/L und 2 g Saccharose/L zur Induktion des Enzyms 220 µkat Fructosyltransferase aus 3 L Kultur erhalten, wobei 46 % der Aktivität extrazellulär vorlagen. Dies entspricht ei-ner gesamthydrolytischen Aktivität2 von 101 µkat/L Kultur. Bei einer analog durchgeführten Kultivierung mit 50 g Mannit/L und 20 g Saccharose/L wurden 140 µkat Fructosyltransferase aus 3 L Kultur erhalten, wobei 79 % der Aktivität extrazellulär war, entsprechend 54 µkat gesamthydrolytische Aktivität/L Kultur.
Gluconobacter cerinus war bislang nicht als Fructosyltransferaseproduzent beschrieben worden. Eliashvili (Mikrobiologiya, 50 (1), 1981) hatte 1981 beschrieben bei einer Kultivierung von Gluconobacter oxydans mit 15 g Mannit/L ohne Saccharose insgesamt 73 µkat gesamthydrolytische Aktivität/L Kulturüberstand erhalten zu haben.11 nkat Fructosyltransferaseaktivität ist definiert als Stoffmengendifferenz aus der während der Biotransformation freigesetzten Glucose minus der freigesetzten Fructose in nmol pro Sekunde.21 nkat entspricht der Freisetzung von 1 nmol Glucose aus Saccharose in 1 Sekunde.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Bisher:Koslik, H.; Lutz-Wahl, S.; Fischer, L.: Neue Glykosyltransferasen für lebensmitteltechnologische Anwendungen Levansucrase aus Rahnella aquatilis ATCC 33071 - Referenzenzym für die Assayentwicklung, Posterpräsentation, Dechema 2002, Wiesbaden.
Koslik, H., Lutz-Wahl, S., Fischer, L.: New fructosyltransferases for potential industrial applications.
Posterpräsentation, 6th International Symposium on Biocatalysis and Biotransformations, 2003, Olomouc, Tschechien.
Publikationen in Peer-Review Journalen (in Vorbereitung):1) Semiautomated screening for new microbial fructosyltransferase producers2) Production and partial characterization of a new fructosyltransferase from Gluconobacter cerinus


Fazit

Das Referenzenzym aus Rahnella aquatilis konnte rekombinant in ausreichender Menge für weitere Untersuchungen verfügbar gemacht werden. Die Kultivierung des Wildstamms zur Gewinnung des Refe-renzenzyms erwies sich aufgrund des gebildeten Levans als ungeeignet.
Das in diesem Projekt entwickelte Screening-Verfahren ist zur schnellen Überprüfung von Mikroorganismen auf Fructosyltransferaseaktivität geeignet.
Bei der Kultivierung des neuen Fructosyltransferaseproduzenten Gluconobacter cerinus waren zunächst Schwierigkeiten hinsichtlich der Biomasseausbeute aufgetreten. Durch Kultivierung mit Mannit als Kohlenstoffquelle und Saccharose zur Enzyminduktion konnte ausreichend Biomasse bzw. extrazelluläres Enzym für weitere Untersuchungen erhalten werden. Aufgrund der anfänglichen Schwierigkeiten bei der Kultivierung war es bislang noch nicht möglich, die Fructosyltransferase aus Gluconobacter cerinus auf-zureinigen und detaillierter zu charakterisieren.