Projekt 13065/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: InnovationsCentrum Biokatalyse ICBio: Entwicklung neuartiger Parallelverfahren zur effektiven Etablierung biokatalytischer Prozesse dargestellt am Beispiel der NAD(H)-Gewinnung für Biotransformationen

Projektdurchführung

Technische Universität MünchenLehrstuhl für Bioverfahrenstechnik
Boltzmannstr. 15
85748 Garching

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Industriell realisierte biokatalytische Verfahren zeichnen sich im Vergleich zur chemischen Synthese durch einen geringeren Energieverbrauch aus, sind zielgerichteter (weitgehende Vermeidung von Neben- und Abfallprodukten) und ressourcenschonender. Die Fortschritte in der biotechnologischen Grundlagenforschung und -anwendung erlauben es heute, Stoffwechselwege gezielt so zu verändern, dass natürliche (aber auch nichtnatürliche) Produkte wie beispielsweise ‚chiral building blocks (Jahresumsatz ~ 2 Mrd. US$) mit höheren Ausbeuten und Selektivitäten hergestellt werden könnten. Damit könnte die chemische asymmetrische Synthese, die unter hohem Druck und hohen Temperaturen, bei Verwendung von giftigen Schwermetallkatalysatoren sowie großer Mengen organischer Lösungsmittel durchgeführt wird, zunehmend zurückgedrängt werden.
Das Kernproblem ist gegenwärtig jedoch die zügige Umsetzung dieser Potenziale in industrielle Produktionsverfahren. Hierzu werden oftmals bis zu 10 Jahre und mehr benötigt. Die heutige sequenzielle Vorge-hensweise (Biokatalysatorentwicklung im Hochdurchsatzverfahren - Bioprozessentwicklung im Laborbioreaktor - Überführung in den Produktionsmaßstab) führt sogar dazu, dass viele potenzielle biokatalytische Ansätze bereits in einer sehr frühen Entwicklungsphase nicht weiter verfolgt werden. Dies gilt besonders, wenn mit den bestehenden Paralleltechniken (Mikrotiterplatten, Schüttelkolben) das Potenzial nicht erkannt werden kann oder aufgrund des enormen Zeit- und Personalaufwands bei der nachfolgenden Prozessentwicklung im Laborbioreaktor nur wenige Biokatalysatoren intensiver untersucht werden können.
Zielsetzung dieses Forschungsvorhabens ist die Bereitstellung der wissenschaftlich-technologischen Grundlagen zur Hochdurchsatz-Bioprozessentwicklung: Hierzu soll ein Modul mit 48 Rührkesselreaktoren im 5 ml-Maßstab als ‚Bioreaktorblock entwickelt, mit paralleler nicht-invasiver Optosensorik zur online pH- und pO2-Messung ausgestattet und mit einem Labor-Roboter automatisiert werden, um sowohl Stamm- als auch Prozessentwicklung zeiteffektiv unter kontrollierten Reaktorbedingungen durchführen zu können. Zur biotechnologischen Evaluierung sollen E. coli und S. cerevisiae als Modellsysteme eingesetzt und beispielhaft durch Optimierung der Reaktionsbedingungen im Parallelansatz die NAD(P)-Gehalte in den Zellen maximiert werden.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenBioreaktorblock
(H+P) Entwicklung eines sterilisierbaren Multireaktoreinsatzes für einen induktiven Multimagnetantrieb für 48 ‚ml-Bioreaktoren in Form eines Bioreaktorblocks, der zunächst simultan in allen Bioreaktoren Drehzahlen von bis zu 2500 rpm ermöglicht.
(TUM) Entwicklung eines gasinducing Magnetrührorgans zur axialen Förderung von der Flüssigkeitsoberfläche zum Boden des Reaktionsgefäßes (‚Einsaugen der Gasphase) und effektive Dispergierung der Gasphase in möglichst kleine Gasblasen mit hoher Stoffaustauschfläche (hohe lokale Energiedissipation) sowie Quantifizierung der Sorptionseigenschaften (kLa-Messungen mit miniaturisierter Sauerstof-foptode).
Parallele Optosensorik (Sensorblock)
(PreSens) Entwicklung eines modularen ‚Optik-Untersetzers zum individuellen Auslesen der beiden optischen Sensoren (pH oder pO2) jedes ‚ml-Bioreaktors. Realisierung eines 2-Kanalprototypen.
(PreSens) Entwicklung einer zentralen Steuereinheit zum Auslesen von 48 parallelen 2-Kanal-Optik-Untersetzer (zentrale Phasendedektionseinheit). Realisierung eines 2x2-Kanalprototypen.
Automatisierung mit einem Pipettier-Roboter
(DASGIP) Entwurf des leittechnischen Ansatzes zur Automatisierung der Parallelreaktoren mit Hilfe eines Labor-Roboters als Aktor (Programmierung der Schnittstelle Pipettier - Leitsystem, Entwicklung und Rea-lisierung der Schnittstelle Optoelektronik - Leitsystem).
(DASGIP) Erste Implementierung (rapid-prototyping) einer parallelen Dosiersteuerung mit Hilfe des Pipettier-Roboters als Aktor.
Biotechnologische Evaluierung
(TUM) Parallele Messung von pH und pO2 mit optisch beschichteten Parallelreaktoren im Bioreaktorblock und Monitoring von pH und pO2 im Parallelansatz bei der Kultivierung von Escherichia coli bzw. Saccharomyces cerevisiae im Bioreaktorblock; erste Parallelansätze zur Maximierung der NAD(P)-Gehalte in diesen Mikroorganismen durch Optimierung der Reaktionsbedingungen. Durch höhere NAD(P)-Konzentrationen in Hefezellen soll zum einen die NAD-Herstellung ökonomisch und ökologisch verbessert werden (höhere Ausbeuten verringern die Abwasser- und Abfallmengen). Zum anderen kann durch den Verzicht auf eine NAD(P)-Zugabe bei Ganzzell-Reduktionen die Ökonomie so weit verbessert werden, dass mehr biokatalytische Prozesse zur Darstellung chiraler Alkohole industriell umsetzbar sind als bisher und damit die entsprechenden umweltbelastenden chemischen asymmetri-schen Synthesen ersetzt werden können.
Mit Hilfe der Hochdurchsatz-Bioprozessentwicklung soll zukünftig ein Quantensprung in der Effektivität der Bioprozessentwicklung ermöglicht, die heutige sequenzielle Arbeitsweise weitgehend überwunden und neue Wege zur verfahrenstechnischen Optimierung biotechnologischer Prozesse eröffnet werden.


Ergebnisse und Diskussion

n

Bioreaktorblock
(H+P) Entwicklung eines Bioreaktorblocks für 48 ml-Bioreaktoren mit integriertem induktiven Multimag-netantrieb: Der Prototyp des Reaktionsblocks ist fertig gestellt und befindet sich bei TUM im Einsatz.
(TUM) Entwicklung und verfahrenstechnische Charakterisierung der Sorptionseigenschaften eines schwebenden Gas induzierenden Magnetrührorgans: Es werden mit Gas induzierenden Rührsystemen im mL-Maßstab ausreichend hohe kLa-Werte von bis zu 0,4 s-1 erreicht.
(H+P) Entwicklung einer sterilen, konvektiv durchströmten Abdeckung der mL-Bioreaktoren mit sterilem Zugang zum automatisierten Flüssigkeitstransfer mit einem Pipettierautomaten: Der Prototyp der Sterilabdeckung ist fertig gestellt und befindet sich bei TUM im Einsatz.
Parallele Optosensorik (Sensorblock)
(PreSens) Entwicklung eines 1-Kanal Messgeräteprototyps für pH- bzw. pO2-Sensor: Kultivierungen mit E. coli im mL-Maßstab mit Referenzmessungen (TUM) zeigten keine Abweichungen beim pO2. Die Abweichungen beim pH sind kleiner 0,1.
(PreSens) Entwicklung eines nebeneinander liegenden 2x2-Kanal Prototypen zur parallelen Messung von pH und pO2: Es wurde statt eines 2x2- bereits ein 8x8-Kanal Prototyp gefertigt und TUM wie geplant am Ende des Projekts für erste Messungen zur Verfügung gestellt.
(TUM) Parallele Messung von pH und pO2 mit optisch beschichteten Parallelreaktoren im Bioreaktor-block: Kultivierungen mit Escherichia coli bestätigen die Funktionsfähigkeit des Messsystems bereits für pO2.
Automatisierung mit einem Pipettier-Roboter
(DASGIP) Entwurf und erste Implementierung des leittechnischen Ansatzes zur Automatisierung der Parallelreaktoren mit Hilfe eines Labor-Roboters als Aktor: Die Ansteuerung der pH-, und pO2- Sensorik ist voll funktionsfähig.
(DASGIP) Erste Implementierung einer parallelen Dosiersteuerung mit Hilfe des Pipettierautomaten als Aktor: Erste Testläufe der parallelen Dosiersteuerung bei TUM.
Biotechnologische Evaluierung
(TUM) Erste Kultivierungen von Escherichia coli im Bioreaktorblock: Im Zulaufverfahren können nach einer Prozesszeit von 20 Stunden Zelldichten von über 20 g L-1 Biotrockenmasse erreicht werden. Der Prozessverlauf ist analog zum Referenzverfahren im 3 L Rührkesselreaktor.
(TUM) Erste reaktionstechnische Untersuchungen im Parallelansatz zur Erhöhung des NAD(P)+-Gehalts in Saccharomyces cerevisiae: Die Zugabe von kostengünstig verfügbaren Vorläufermetaboliten der NAD(P)+-Biosynthese führt zu erhöhten NAD(P)+-Gehalten. Mit solchen Zellen konnten höhere Ausbeuten bei der asymmetrischen Synthese von (S)-4-Chlor-3-Hydroxybuttersäureethylester erzielt werden.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

- Puskeiler, R., Zacher, K., Ducret, A., Weuster-Botz, D.: Stirred-tank bioreactors at mL-scale. Vor-trag 21. DECHEMA Jahrestagung der Biotechnologen, 02.-04.04.2003, Garching.
- Puskeiler, R., Weuster-Botz, D.: Exponat ‚Hochdurchsatz-Bioprozessentwicklung, 21. DECHEMA Jahrestagung der Biotechnologen, 02.-04.04.2003, Garching.
- Puskeiler, R., Weuster-Botz, D.: Vortrag mL-scale bioreactors as a tool for process design. Vortragstagung des GVC-Fachausschusses Bioverfahrenstechnik und des DECHEMA-Arbeitsausschusses Technik biologischer Prozesse, 26.-28.05.2003, Bad Dürkheim.
- Puskeiler, R., Weuster-Botz, D.: Stirred-tank bioreactors at mL-scale. Vortrag BASF AG, 08.07.2003, Ludwigshafen.- Puskeiler, R., Zacher, K.-H., Ducret, A., Weuster-Botz, D.: Poster Parallel stirred bioreactors at mL-scale for high throughput bioprocess design. European Conference on Biotechnology 11, 24.-29.08.2003, Basel.
- Weuster-Botz, D., Puskeiler, R.: Parallelbioreaktoren zur Hochdurchsatz Proteinexpression. Vortrag Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), 17.09.2003, Heidelberg.
- Weuster-Botz, D., Puskeiler, R.: Parallelreaktoren für Ganzzellbiokatalysatoren. Vortrag VAAM-Sommerschule Biokatalyse, 18.09.2003. Bad Herrenalb.
- Weuster-Botz, D., Puskeiler, R., Kaufmann, K., John, G., Arnold, M. (2003): Hochdurchsatz-Bioprozessentwicklung. Transkript, Sonderband Nachhaltige Biokatalyse: 55-58.
- Puskeiler, R., Weuster-Botz, D.: Exponat ‚Bioreaktorblock, DBU-Präsentation auf der Biotechnica 2003, 07.-09.10.2003, Hannover.
- Weuster-Botz, D., Puskeiler, R.: Neue Ansätze zur Hochdurchsatz-Bioprozessentwicklung. Vortrag DECHEMA, 29.10.2003, Frankfurt.
- Puskeiler, R.: Parallel bioreactors for bioprocess development. BioPerspectives 2004, 04.-06.05.2004, Wiesbaden.
- Puskeiler, R., Kusterer, A., Weuster-Botz, D.: Development of parallel-operated mL-scale bioreactors for bioprocess design. GVC/DECHEMA Vortrags- und Diskussionstagung Simultane und integrierte Bioprozessentwicklung, 17.-19.05.2004, Eisenach.
- Puskeiler, R., Kaufmann, K., Weuster-Botz, D. (2004): Development, parallelization and automation of a gas-inducing mL-scale bioreactor for high-throughput bioprocess design (HTBD). Biotechnol Bioeng, accepted.
- Puskeiler, R., Weuster-Botz, D. (2004): Rührkesselreaktoren im mL-Maßstab: Kultivierung von E-scherichia coli. Chemie Ingenieur Technik, akzeptiert.
- Puskeiler, R., Kusterer, A., John, G., Weuster-Botz, D. (2005): Miniature bioreactors for automated high-throughput bioprocess design (HTBD): Comparability of parallel cultivations with Escherichia coli. Biochem Eng J, submitted.


Fazit

Im Projektverlauf konnten alle Projektziele und Meilensteine fristgerecht verwirklicht werden.