Projekt 13053/31

Förderschwerpunkt Biotechnologie: Innovative enzymatische Gasphasenreaktionen zur umweltschonenden Herstellung optisch aktiver Feinchemikalien

Projektdurchführung

Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule(RWTH) AachenLehrstuhl für Bioverfahrenstechnik
Worringerweg 1, Sammelbau Biologie
52074 Aachen

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Der größte Anteil derzeit hergestellter optisch aktiver Feinchemikalien wird noch klassisch chemisch synthetisiert. Enzymatische Biotransformationen gewinnen aber zunehmend an Bedeutung. Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung eines kontinuierlichen enzymatischen Gasphasenreaktors zur Herstellung optisch aktiver Alkohole und die Entwicklung eines Verfahrens, welches mit den etablierten Verfahren konkurrieren kann. Der Einsatz enzymkatalysierter Stoffwandlungsverfahren in der Gasphase ist aus ökologischen und ökonomischen Gesichtspunkten deshalb so interessant, da Edukte umgesetzt werden können, die in wässrigen Medien nur sehr schlecht löslich sind, ohne dass organische Lösungsmittel verwendet werden müssen. Die problematische Entsorgung oder Aufarbeitung der organischen Lösungsmittel entfällt daher. Weiterhin ergeben sich bedeutende Vorteile bei der Aufarbeitung der Produkte und bei deren Abtrennung von eventuell nicht umgesetzten Edukten. Auch in der Aufarbeitung entfällt die Notwendigkeit, organische Lösungsmittel einzusetzen, woraus sich eine zusätzliche Umweltentlastung bei der Produktion ergibt.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenEs wurden Alkoholdehydrogenasen sowohl aus mesophilen als auch thermophilen Mikroorganismen eingesetzt. Die Bereitstellung und Testung geeigneter enzymatischer Präparate obliegt der Julich Chiral Solutions GmbH. Dazu werden zuerst Versuche in der Flüssigphase durchgeführt. Am Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik werden die Enzyme für den Einsatz in der Gasphase präpariert. Es wurden Batch- und kontinuierliche Reaktoren zur Durchführung des ersten Screenings entwickelt. Das Reaktionssystem wurde durch regelmäßige Probennahme, die im GC gemessen werden, analysiert. Zur Herstellung von Produkt im größeren Maßstab wurde ein kontinuierlicher Enzym-Gasphasen-Festbettreaktor auf Edel-stahl-Basis gebaut und optimiert. Die Enzympräparationen und Betriebsbedingungen, die sich bei den Vorversuchen als günstig erwiesen haben, werden als Orientierungsgrundlage für die Optimierung der Parameter im kontinuierlichen Betrieb dienen.


Ergebnisse und Diskussion

Die Bearbeitung des Projekts Enzymatische Gasphasenreaktionen hat auf verschiedenen Ebenen Erkenntnisse geliefert, die den vorherigen Stand des Wissens entscheidend voran gebracht haben. Die Mechanismen der enzymatischen Gasphasenreaktionen konnten grundsätzlich geklärt werden und fungieren als Basis für die Prozessoptimierung hinsichtlich eines späteren umweltschonenden Produktions-verfahrens. Eine systematische Optimierungsmethode wurde mit der Reduktion von Acetophenon zu (R)-Phenylethanol als Standardreaktion entwickelt, die leicht zu anderen Reaktionssystemen übertragen werden kann.
Die Bereitstellung der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis wurde zuerst durch das Institut für Enzymtechnologie (IET), ab dem zweitem Projektjahr durch die Julich Chiral Solutions GmbH ermöglicht. Neue thermostabile Enzyme haben sich als sehr interessante Katalysatoren bewiesen und werden zuerst durch die Julich Chiral Solutions GmbH weiter untersucht.
Für die Herstellung des Enzympräparats wurde die Lyophilisierung aufgegeben und eine systematische Untersuchung der optimalen Immobilisierungsmethode, die in diesem System die höchsten enzymatischen Aktivitäten bei maximaler Enzymstabilität gewährleistet, verfolgt. Dabei konnte gezeigt werden, dass unter optimierten Bedingungen die adsorptive Immobilisierung der ADHs auf Glasträgern zu einer Aktivierung der ADH im Vergleich zur Lösung führt. Wesentliche Parameter hierbei sind Saccharose als Stabilisator, ein geeigneter Puffer (50 mM Phosphatpuffer, pH 7). Wider Erwarten zeigte das thermostabile Enzym aus Thermoanaerobacter sp. im Vergleich zu ADH aus Lactobacillus brevis (LB ADH) bisher keine erhöhte Stabilität in der Gasphasenreaktion.
Mit kinetischen Daten der Umsetzung von Acetophenon zu (R)-1-Phenylethanol, katalysiert durch LB ADH, erfolgte eine Auslegung des Gasphasenreaktors in guter Übereinstimmung zu experimentellen Ergebnissen. Eine Übertragbarkeit der Methodik konnte anhand der Umsetzung von 2-Octanon ebenfalls gezeigt werden. Mit einer halbtechnischen Umsetzung von Acetophenon über 10 Tage konnten 1,7 g (R)-1-Phenylethanol hergestellt werden. Die Produktivität erreichte dabei 107 g/L/d und die Total Turnover Number 7.106 bezogen auf den Enzymeinsatz.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Jahr 2001: Bioforum, Lüttich, 04.05.01 (Poster).
Jahr 2002: 20. GVC/Dechema-Jahrestagung, Wiesbaden 11.-13.06.02 (Vortrag); 4th European Sympo-sium of Biochemical Engineering Science, Delft, 28.-31.08.02 (Poster); Cell@Work, Maastricht, 28.11.02 (Poster).
Jahr 2003: ACHEMA, Frankfurt, 18.-24.05.03 (Ausstellung); 11th European Congress on Biotechnology, Basel, 24.-29.08.03 (Poster).
Jahr 2004: Bioperspectives 2004, Wiesbaden, 04.-06.05.04 (Vortrag), Biocat 2004, Hamburg, 29.08.-01.09.04 (Poster und Vortrag).


Fazit

Das Forschungsvorhaben Innovative Ansätze zur umweltschonenden Herstellung optisch aktiver Feinchemikalien konnte mit wenigen Änderungen von Projektmethodik und Projektstruktur zum Ziel geführt werden. Es konnte ein wettbewerbsfähiges Verfahren zur Herstellung von (R)-1-Phenylethanol etabliert werden, wobei gleichzeitig gezeigt wurde, dass auch höher siedende Substanzen erfolgreich in der Gas-phase umgesetzt werden können.
Aus den während des Projekts gewonnenen Erfahrungen konnten für die Etablierung neuer Reaktionssysteme wesentliche Prinzipien erarbeitet werden. Bei der Immobilisierung von Enzymen werden sich zukünftige Optimierungen auf Stabilisatoren und Puffersysteme beschränken können. Allerdings muss die Aktivität und Stabilität in der Gasphase untersucht werden, da keine Übertragbarkeit dieser Eigenschaften von der Flüssig- auf die Gasphase besteht. Gleichermaßen kann nicht davon ausgegangen werden, dass ein Enzym aus einem thermophilen Organismus zwangsläufig auch in der Gasphase bessere Stabilität als ein Enzym aus einem mesophilen Organismus zeigt.
Zur Optimierung des Reaktionssystems zeigte der kontinuierliche Gasphasenreaktor insbesondere durch die online-Analytik unerwartete positive Eigenschaften. Die kinetischen und Gleichgewichtsuntersuchungen konnten mit einem hohen Grad an Genauigkeit und direkt für die Auslegung genutzt werden.