Projekt 13053/26

Förderschwerpunkt Biotechnologie: Verbund Biotechnologie in der Lebensmittelwirtschaft – Innovative Problemlösungen in Kooperation zwischen Hochschulen und mittelständischen Industrieunternehmen: Optimierung von DNA-Arrays zur Analyse von Milch und M[…]

Projektdurchführung

Universität BremenZentrum für Umweltforschung und Umwelttechnologie (UFT)Biotechnologie und Molekulare Genetik
Leobener Str.
28359 Bremen

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Das deutsche Lebensmittelrecht schreibt für Milch und Milchprodukte zahlreiche Qualitätskontrollen vor. Ziel der z. T. mehrtägigen, erst nach Ablauf des Produktionsprozesses durchgeführten Tests ist es, den Verbraucher vor Krankheitserregern, wie z. B. coliformen Bakterien, zu schützen. Der Schwerpunkt liegt dabei auf Seiten des Verbraucherschutzes und nicht im Bemühen, potenzielle Fehlproduktionen und die damit verbundenen Umweltbelastungen zu verhindern, die bei der Entsorgung der Fehlchargen und der Reinigung der Fermenter entstehen.
Kernpunkt des vorliegenden Projekts war es, potenzielle Fehlchargen bei der Herstellung von Milchprodukten bereits im Vorfeld der Milchverarbeitung zu erkennen und zu vermeiden, indem mit Hilfe der Mikroarray-basierten Gen-Analyse alle wichtigen biologischen Parameter simultan erfasst werden, die Auskunft über den Zustand der zu verarbeitenden Milch bzw. über die Aktivität der Starterkulturen während der Milchfermentation geben. Auf Basis der neuen Methode der DNA-Chip-Technologie soll dafür ein schnelles und kostengünstiges Analysesystem aufgebaut werden.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie neue Technologie der DNA-Chip-Hybridisierung bietet die Chance, ein Monitoring-System zu entwickeln, das in einem Arbeitsgang die erforderlichen Informationen über die mikrobiologische Zusammensetzung und das genetische Potenzial der an der Fermentation beteiligten Mikroorganismen liefert und damit eine Prognose über den Fermentationsverlauf erlaubt. Die Aufgaben des Projekts sind folgende:
1. Festlegung der für die Beurteilung der Milch und deren Verarbeitung erforderlichen Gen-Analysen.
2. Optimierung der Gen- und Organismusspezifischen Oligonukleotidsequenzen im Hinblick auf maximale Hybridisierungseffizienz und minimale unspezifische Bindungsreaktionen der Sonden auf dem DNA-Mikroarray.
3. Optimierung der Funktionalität derartiger DNA-Chips und Erprobung ihrer Einsetzbarkeit für die frühzeitige Erkennung von Milch-Fehlfermentationen unter Praxisbedingungen.


Ergebnisse und Diskussion

Reproduzierbarkeit der Chipqualität und erweiterte Qualitätskontrolle
Basierend auf den optimierten Produktionsparametern wurde ein standardisiertes, auf kontaktfreiem Spotten basierendes Verfahren für die Produktion der Mikroarrays eingeführt, das es erlaubt, die Milch-Chips in sehr hoher und reproduzierbarer Qualität herzustellen, zu lagern und an den Kunden zu versenden. Zusätzlich wurden neue Qualitätskontrollverfahren in die Produktion der Milch-Chips integriert und eine Markierungstechnologie entwickelt, die es erlaubt, die Arrays mit einem weitestgehend fälschungssicheren Barcode auszustatten.
Design und Spezifität der Sonden für den Nachweis von Bakterien, Phagen, Hefen, Schimmelpilzen und produktspezifischen Genen
Als Grundlage der praxisorientierten Entwicklung eines Chip-basierten Analysesystems für die Milchindustrie wurden mehr als 100 Gen-Sonden zur spezifischen Identifikation von Bakterien, Phagen und produktspezifischen Genen ausgewählt und getestet. Dieser für den Milch-Chip vorgesehene Sondensatz wurde um diverse Sonden für den Nachweis von Hefen und Schimmelpilzen, wie z. B. Zygosaccharomyces bailii, S. cerevisiae, Pichia-, Penicillium- und Aspergillus-Arten erweitert und auf Spezifität und Eignung zur Organismusidentifizierung hin optimiert.
Markierung und Hybridisierung genomischer DNA aus Milchprodukten
Für den erforderlichen Nachweis von genomischer DNA auf dem DNA-Mikroarray wurden zunächst die Extraktion sowie die Fragmentierung der DNA in der Fenton-Reaktion etabliert. Nachdem in der Eingangsphase des Projekts festgestellt worden war, dass die im Antrag dargestellten, in der medizinischen Diagnostik üblichen Methoden für den Routine-Einsatz in der Milchindustrie zu teuer sind, wurde ein kostengünstiges, chemisches Markierungsverfahren entwickelt, das auf der kovalenten Anbindung von Psoralen-PEO-Biotin und Streptavidin-Cy5-Zugabe beruht. Ein umfangreiches Optimierungsprogramm führte schließlich dazu, dass mit diesem Verfahren Starterkultur- und Molkeproben hinsichtlich ihrer Organismenzusammensetzung und der Anwesenheit von Phagenresistenzgenen untersucht werden können.
Marktanalyse, Marketing und Patentstrategie
Die bei den Anwendern durchgeführte Marktanalyse, die das derzeitige Analysespektrum und dessen Kosten, das gewünschte Marker-Spektrum und die wirtschaftlichen, ökologischen und technologischen Parameter umfasste, sowie die Prüfung, ob die hier etablierte Analytik die Schutzrechte Dritter berührt, und ob entsprechende Abhängigkeiten bestehen, zeigte zunächst, dass bei Erfüllung der Projektziele sehr gute Vorzeichen für eine kommerzielle Verwertung bestehen. Die im Projektzeitraum deutlich verän-derten wirtschaftlichen Rahmenbedingungen führten bei erneuter Abschätzung zum Projektende zu dem Ergebnis, dass, obwohl alle wesentlichen Projektziele erreicht wurden, der Milch-Chip innerhalb der nächsten drei Jahre kein ausreichendes Marktpotenzial für eine Markteinführung besitzt.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Glöckner, C.B. and Blohm, D. (2003): Vortrag bei der COST action 853 Agricultural biomarkers for array technology der Europäischen Union, Working group 4: Applying microarray technology in milk industry, 24.-26. September, Bremen.
Glöckner, C.B. und Blohm, D. (2003): Vortrag Stand und Perspektiven der Einsatzmöglichkeit von DNA-Mikroarrays im Milchverarbeitungsprozess Lebensmitteltechnologie 2003, 25.-27. September, Stuttgart.Glöckner, C.B., Schmidt, M.P., Weiß, S., Würdemann, C., Wagner-Prigge, K. and Blohm, D.H. (2004): Analysis of milk products as an example for the applicability of the microarray technology in the food industrie. Posterpräsentation auf dem Statusseminar Chiptechnologien, 24.-25. Januar, Frankfurt.


Fazit

Trotz erfolgreicher Ausarbeitung eines Verfahrens, das erstmals die Simultan-Analyse diverser Mikroorganismen und deren genetischen Eigenschaften in Starterkulturen und Milchprodukten mit Hilfe der DNA-Mikroarray-Technologie erlaubt, wird die Milchindustrie dieses Verfahren angesichts des enormen Kostendrucks und des derzeitigen Preisverfalls bei den bisherigen Analyseverfahren innerhalb der nächsten 5 Jahre vermutlich noch nicht einsetzen, insbesondere da das neue Milch-Chip basierte Verfahren noch nicht als gesetzlich vorgeschriebenes und/oder nach §35 LMBG zugelassenes Analyseverfahren eingeführt ist.