Projekt 13053/21

Förderschwerpunkt Biotechnologie: Verbund Biotechnologie in der Lebensmittelwirtschaft – Innovative Problemlösungen in Kooperation zwischen Hochschulen und mittelständischen Industrieunternehmen: Entwicklung eines innovativen Mykotoxin-Antikörper-Arrays

Projektdurchführung

R-Biopharm AG
An der neuen Bergstr. 17
64297 Darmstadt

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Mykotoxine stellen auf Grund ihrer toxischen Bewertung und einer gewissen Häufung von kontaminierten Lebens- und Futtermittelproben für den Verbraucher ein nicht zu unterschätzendes Gefährdungspotenzial dar. Die Gesundheit, Leistungsfähigkeit und Fertilität von Zuchttieren wird durch Mykotoxine ebenfalls er-heblich beeinträchtigt. Maßgeblich für die Eindämmung der Kontamination in prozessierten Lebensmitteln und in Futtermitteln ist die Überwachung der Qualität der eingesetzten Rohstoffe. Mit dem Mykotoxin-Antikörper-Array sollte ein Test entwickelt werden, der es ermöglicht in einem einzigen Analysensystem mehrere relevante Mykotoxine gleichzeitig zu erfassen. Der Test sollte sich durch eine einfache Durch-führung und eine kurze Analysezeit auszeichnen und damit eine schnelle Beurteilung der untersuchten Probe erlauben.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenZunächst wurden die für den Testaufbau notwendigen spezifischen Reagenzien wie Antikörper und enzymmarkierte Mykotoxine beim Kooperationspartner hergestellt. Bei R-Biopharm wurden die für Vergleichsmessungen erforderlichen HPLC-Methoden für die Bestimmung der Mykotoxine etabliert. Mit den spezifischen Reagenzien wurden danach die Einzeltests für den Nachweis von Aflatoxin, Ochratoxin A, Deoxynivalenol, T-2 Toxin, Fumonisin und Zearalenon unter Berücksichtigung der angestrebten Messbe-reiche entwickelt. Als Plattform für die Testentwicklung diente die 96-well Mikrotiterplatte. Die Detektion wurde mit Hilfe einer photometrischen Messung vorgenommen. Die Komponenten der Einzeltests wur-den zu einem integrierten Multisystem zusammengesetzt, wobei die spezifischen Antikörper in einem optimierten Beschichtungsverfahren über Fängerantikörper in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte fixiert wurden. Die Mykotoxin-Standardlösungen wurden entsprechend der jeweiligen Messbereiche gemischt und auf drei Konzentrationsstufen eingestellt. Ebenso wurden Mischungen der Enzymkonjugate in Verdünnungen hergestellt, die in Schachbretttitrationen ermittelt worden waren. Der Test wurde hinsichtlich seiner analytischen Spezifikation und Stabilität der Testkomponenten charakterisiert. Danach wurde die Einsatzmöglichkeit des Mykotoxin-Antikörper-Array für die Analyse von Proben untersucht.


Ergebnisse und Diskussion

Durch eine optimale Zusammenstellung von monoklonalen Antikörpern und Enzymkonjugaten konnte ein empfindlicher Mykotoxin-Antikörper-Array-Test für die gleichzeitige Analyse von fünf der geplanten Mykotoxine entwickelt werden. Die Gesamtanalysezeit konnte auf ca. 30 Minuten eingestellt werden. Der Test wurde entsprechend der 2 x 10 Minuten Inkubationen Mykotoxin-Antikörper-Array 10/10 benannt.
Die 50 %-Dosis-Werte (mittlerer Konzentrationsbereich der Standardkurve) der einzelnen Mykotoxine lag bei ca. 0,3 ppb (Aflatoxin), 22 ppb (DON), 23 ppb (Fumonisin), 1 ppb (T-2 Toxin) und 4 ppb (Zearalenon). Durch die Probenaufarbeitung wurde der Messbereich um Faktor 10 bzw. 50 verschoben. Dadurch wur-den Messungen im relevanten Konzentrationsbereich für die Lebensmittel- und Futtermittel-Kontrolle ermöglicht.
Nach Abschluss der Entwicklungsarbeiten wurden 4 Chargen des Array-Testkits in gleicher Weise hergestellt und hinsichtlich Chargenkonformität, Lagerstabilität der Testkit-Komponenten und Reproduzierbarkeit der Testergebnisse charakterisiert.
Kits der unterschiedlichen Chargen zeigten eine ausgezeichnete Übereinstimmung hinsichtlich Lage und Form der Mykotoxin-Standardkurven, sodass eine reproduzierbare Herstellung des Arrays mit gleichbleibender analytischer Qualität der Testkits gewährleistet sein sollte. Die Testkomponenten waren bei der empfohlenen Lagerung bei 4 - 8°C über einen Beobachtungszeitraum von mindestens 6 Monaten stabil.
Die Untersuchung der Intra- und Interassay Reproduzierbarkeit wurde auf der Basis von dotierten Nullproben durchgeführt und ergab für die Reproduzierbarkeit innerhalb eines Testlaufs VK-Werte von 3 bis 10 %. Für die Interassay-Reproduzierbarkeit wurden bei Auswertung von fünf unabhängigen Tests VK-Werte zwischen 7 und 28 % (Mittelwert 13,9 %) im Bereich der 50 % Dosis Werte gemessen.
Die analytische Leistungsfähigkeit in Bezug auf die Probenanalyse wurde mit 22 unbelasteten Getreide- und Futtermittelproben, sowie 25 Mykotoxinhaltigen Kontrollproben geprüft. In der letzten Phase des Projekts wurde der Test erfolgreich zur Charakterisierung von 41 Getreideproben, die aus regulären Kundenanfragen stammten, verwendet.
Die mit dem Array erhaltenen Ergebnisse wurden mit Referenzdaten verglichen und für eine qualitative Bewertung anhand von cut off-Werten als negativ (Ergebnis < cut) oder positiv (Ergebnis ³ cut off) eingestuft. Die cut off-Werte wurden auf der Basis der 50 % Dosis der Mykotoxin-Standardkurven für die 1:10 verdünnten Proben wie folgt festgelegt: Aflatoxin 3 ppb, DON und Fumonisin 200 ppb, T-2 Toxin 10 ppb und Zearalenon 40 ppb. Für die Auswertung der 1:50 verdünnten Proben erhöhten sich diese Werte um Faktor 5.
Die Testspezifität lag auf der Grundlage dieser cut off-Werte bei der Untersuchung von 22 unbelasteten Proben bei 95,4 %. Von 220 Analysenergebnissen der Nullproben lagen 214 unterhalb der cut off-Werte und wurden somit als negativ (NEG) eingestuft. Die Testsensitivität wurde auf der Basis von Mykotoxin-belasteten Kontrollproben mit 1:10 verdünnten Proben mit 100 % ermittelt. Alle mit Mykotoxin kontaminierten Proben wurden in Übereinstimmung mit dem Vergleichstest POS bestimmt.
Bei der Auswertung der Ergebnisse von insgesamt 88 Getreide- und Futtermittelproben wurde eine zufriedenstellende Übereinstimmung mit den Einstufungen der Referenztests gefunden. Die gute Übereinstimmung von Array und Vergleichsdaten spiegelte sich auch in den Korrelationsdiagrammen wider. In einer Gesamtdarstellung aller quantitativ bestimmbaren Wertepaare (n=103) wurde eine Regressionsgerade mit Steigung 0,994 und einem Bestimmtheitsmaß von r2 = 0,877 ermittelt.
Eine gewisse Einschränkung der Testqualität stellt die vergleichsweise große Zahl von nicht mit dem Referenztest übereinstimmenden positiven Bewertungen für DON (9/40) und Zearalenon (14/33) bei Proben dar, die im Bereich des cut off gemessen wurden.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Das Projekt wurde im Frühjahr 2003 auf zwei internationalen Messen (Achema und der Anuga Foodtec) in Form eines Posters und in Form von Flyern vorgestellt. Anlässlich der Biotechnica wurde im Oktober 2003 in einer Sonderausgabe von transkript ein Artikel mit dem Titel Innovative Nachweisverfahren für Mykotoxine veröffentlicht, in dem das Projekt gemeinsam mit dem DBU Projekt AZ 13059 (Detektion von Mykotoxinen durch Plantibodies) beschrieben wurde.


Fazit

Mit dem Mykotoxin-Antikörper-Array 10/10 wurde auf der Basis von monoklonalen Antikörpern ein immunologisches Nachweissystem etabliert, das in einem Analysengang gleichzeitig fünf der wichtigsten Mykotoxine (Aflatoxine, DON, Fumonisine, T-2 Toxin und Zearalenon) in den jeweils relevanten Messbereichen erfasst. Getreide und Futtermittelproben lassen sich nach einer einfachen Probenaufarbeitung mit 1:10 und 1:50 Verdünnungen im Test innerhalb von ca. 30 Minuten messen.
Der Array Test kann sowohl quantitative Ergebnisse anhand der Mykotoxin-Standardkurven als auch qualitative Ergebnisse anhand von cut off-Werten liefern, die noch unter den in EU-Verordnungen festge-legten oder in Richtlinien für Futtermittel empfohlenen Höchstmengen liegen.
Die ursprünglich geplante Integration von Ochratoxin A in den Array ist aufgrund einer unzureichenden Qualität der zur Verfügung stehenden monoklonalen Antikörper nicht gelungen. Eine geringe Einschränkung zeigte der Array beim Einsatz in der Probenanalytik hinsichtlich von falsch positiven Befunden im Bereich der cut off-Werte von DON und Zearalenon. Hier würde sich eine Anhebung der cut off-Werte zur Verbesserung der Testspezifität anbieten, da die bisher auf der Basis der 50% Dosis festgelegten cut off-Werte noch deutlich unterhalb der vom Gesetzgeber festgelegten Höchstmengen liegen.
Durch den Einsatz einer visuellen Stopp-Lösung konnte eine Testvariante etabliert werden, mit dem eine semiquantitative Differenzierung im Bereich der cut off-Werte der Mykotoxin-Standardkurven möglich war. Damit steht ein einfach zu handhabender Test zur Verfügung, mit dem Mykotoxin-Belastungen ohne einen Mikrotiterplatten-Reader visuell detektiert werden können.
Die Chancen für einen kommerziellen Einsatz des Mykotoxin-Antikörper-Array Kits werden als sehr gut betrachtet, da für vier der Mykotoxine EU-Verordnungen existieren, die entweder schon in Kraft sind oder in Kürze gültig sein werden. Mit diesen Verordnungen werden Höchstmengen festgelegt, die von den Messbereichen des Arrays sehr gut abgedeckt werden.