Projekt 13040/16

Förderschwerpunkt Biotechnologie: Verbund Industrielle Nutzung von Biokatalysatoren: Entwicklung einer innovativen DNA-Chip-Technologie zur industriellen Herstellung rekombinanter Proteine mit dem Ziel hoher Raum-/Zeit-Ausbeuten sowie optimalen Ressource

Projektdurchführung

Technische Universität Hamburg-HarburgInstitut für Mikrosystemtechnik
Eißendorfer Str. 42
21073 Hamburg

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Ziel des Projekts beinhaltet die Etablierung und Optimierung der DNA-Chip Technologie für den Routineeinsatz in Forschungs- und Anwendungsgebieten, wo komplexe Nukleinsäuregemische schnell und umfassend detektiert werden müssen. Eine kostengünstige Parallelisierung und Miniaturisierung des DNA-Chips, die die Bearbeitungszeit und die erforderlichen Probenmengen um mehrere Größenordnungen reduzieren, bedeuten produktintegrierten Umweltschutz durch Vermeidung bzw. Verringerung von Abfall und sind aus diesen Gründen das primäre Ziel des Projekts. Im Zuge der Optimierung von DNA-Chip-Technologie soll ein neues Detektions- und Drucksystem entwickelt werden, das ein einfaches, kostengünstiges und anwendungsorientiertes Verfahren zur Herstellung von DNA-Chips bietet.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Optimierung und die Herstellung von DNA-Chip-Drucksystemen sowie von Chips waren dazu geeignet ergänzende Erkenntnisse für die Charakterisierung des Überflussmetabolismus im E.coli-Stamm über Genomweite Expressionsanalyse zu gewinnen. Zur Herstellung von E.coli-DNA-Chips wurden alle Gene dieses Organismus mit spezifischen Primern PCR-amplifiziert. Nach Überprüfung der Identität und des Reinheitsgrads der PCR-Produkte wurden diese mit einem DNA-Chip Roboter auf modifizierten Glasoberflächen immobilisiert. Mit diesen hergestellten Chips wurden die Untersuchungen zur globalen Veränderung der Genexpression von E.coli beim Überflussmetabolismus durchgeführt. Zur Etablierung einer Chip-Hybridisierung zur Analyse von komplexen, prokaryontischen Mischkulturen wurden vorwie-gend molekularbiologische Methoden angewendet. Die Vorraussetzungen für die Chip-Hybridisierungen wurden mit folgenden angewandten Methoden erreicht: Bakterienkultivierung in Flüssigmedien, RNA-Isolierung und Konzentrierung, Polyacrylamidgelelektrophorese, cDNA-Synthese, Fluoreszenzmarkie-rung, Präparation der Poly-L-Lysin-Chips und Nachbehandlung der Arrays.
Im Zuge der Entwicklung von DNA-Chip-Drucksystemen wurden die etablierten Plasmapolymerisierungs- und plasmaunterstütztes Ätz-, Verbindungs- und Beschichtungsverfahren verwendet. Dazu gehören LPCVD-Beschichtungsverfahren, Plasmapolymerisierungsmethoden, nasschemische Tiefenstrukturierung in Kaliumhydroxidlösung und plasmaunterstützte Ätzprozesse.


Ergebnisse und Diskussion

Im Jülicher Teilprojekt gelang die Etablierung und Optimierung von DNA-Fragment-Chips für die Genom-weite Expressionsanalyse. Zunächst wurde die Analysetechnik für den Modellorganismus Escherichia coli validiert und lieferte sowohl innerhalb dieses Teilprojekts als auch projektübergreifend neue Ansät-zen für die Optimierung der Stoffwechselleistung dieses Bakteriums im Hinblick auf seine biotechnologische Anwendung. Im Einzelnen sind die folgenden Punkte erreicht worden:
1. Bereitstellung das gesamte E. coli-Genom umfassender DNA-Fragment-Chips
2. Validiertes Protokoll für Genomweite Expressionsanalysen mit E. coli-DNA-Chips 3. Identifizierung von E. coli-Genen, deren Expression a) bei Kohlenstoff-Limiterung oder b) bei Ü-berflussmetabolismus durch Phosphat-Limitation oder c) bei Überflussmetabolismus durch Sulfat-Limitation verändert ist. Die Teilziele wurden im Wesentlichen erreicht und darüber hinaus wurde das Acetat-Stimulon, d.h. die Gruppe an Genen, deren Expression durch die Anwesenheit des Überflussmetaboliten Acetat verändert wird, identifiziert.
4. Neue Ansatzpunkte für die Stamm-Optimierung bei der Pyruvat-Produktion mit E. colia) Identifizierung von E. coli-Genen, deren Expression sich mit den Phasen der Pyruvat-Produktion verändert
b) Genom-umfassende Charakterisierung der Auswirkungen von Gen-Inaktivierungen, die zum metabo-lic design von Pyruvat-Produktionsstämmen durchgeführt wurden. Innerhalb dieser Zusammenarbeit gelang es die Genexpressionsunterschiede zwischen Stämmen, die sich in ihrer Pyruvatproduktionskapa-zität unterschieden, zu identifizieren. Diese Arbeiten lieferten neue Anhaltspunkte zur Optimierung der Pyruvatproduktion mit E. coli.
Ziel des Teilprojekts der Technischen Mikrobiologie ist die Etablierung eines Oligonukleotid-Chip-Prototyps, der die Detektion und Identifikation von bierkontaminierenden Bakterien ermöglicht, um im Fall einer Kontamination rechtzeitig korrigierend in den Prozess eingreifen zu können. Der Schwerpunkt des Teilprojekts liegt in der Entwicklung eines bedarfsorientierten und anwenderfreundlichen Systems zur Routineanalyse, das nach der Entwicklung vom Prototypen zum gebrauchsfertigen Endprodukt, die momentan obligatorischen und zeitaufwändigen Methoden der Kultivierung und Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ersetzen soll. Erlaubt wird dies durch die Kombination verschiedener Parallelanalysen auf einem Chip, die sowohl das Vorhandensein als auch die Lebensfähigkeit der kontaminierenden Bakterien anzeigen.
Ziel des Teilprojekts des AB Mikrosystemtechnik ist ein schnelles und Rohstoffeinsatz verminderndes Drucksystem für DNA-Chips zu entwickeln. Dafür sollen mit Hilfe der in der Mikrosystemtechnik etablierten Methoden ein multifunktioneller Druckkopf und ein dazugehöriger Basis-Chip mit modifizierter Oberfläche hergestellt werden.
Es wurden die plasmapolymerisierten Schichten für hydrophobe Oberflächen aus Tetrafluorethylen getestet und für den Einsatz auf Basis-Chip (Glas) optimiert. Die Strukturierung der Schicht für übersprechfreie Medienübertragung ist gelungen. Durch ein neues, gemeinsam mit Fa. SLS konzipiertes und im AB Mikrosystemtechnik realisiertes thermopneumatisches Antriebsprinzip wurde eine signifikante Miniaturisierung und die komplette Integration der einzelnen elektrischen und Fluidik-Komponenten des Druckkopf-Chips als ein einheitliches System erreicht. Das Druckkopf-Konzept eines Zwei-Fluidiknetz-Systems erwies sich als nichtinvarsiv gegenüber des DNA enthaltendes Mediums.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Es wurden 6 begutachtete und 3 nichtbegutachtete Publikationen veröffentlicht. Die Projektergebnisse wurden auf 5 Postern bei Fachtagungen der DECHEMA oder der VAAM präsentiert und waren Gegenstand von 10 Vorträgen in Industrie und Wissenschaft, davon 5 im Ausland (Brasilien, Indien, Korea, Nie-derlande, Schweiz).


Fazit

Wie im Antrag geplant, gelang es die DNA-Chip-Technik für den Modellorganismus E. coli zu etablieren und zur Charakterisierung des Acetatstresses und der aeroben Acetatbildung erfolgreich einzusetzen.
Die in dem Projekt erzielten Ergebnisse zeigen, dass neben den durch die Miniaturisierung bedingten rein quantitativen Vorteilen, die DNA-Chip-Analysen auch qualitativ eine neue Ebene bei der funktionellen Untersuchung von Genen eröffnen. Außerdem vertieft der Einsatz der neuen DNA-Chip-Technik das Wissen über zelluläre Systeme und bietet damit ein großes Potenzial zur Optimierung insbesondere der biotechnologischen Prozesse, in denen Zellen als Biokatalysatoren wirksam sind.