Projekt 13040/09

Förderschwerpunkt Biotechnologie: Verbund Industrielle Nutzung von Biokatalysatoren: Entwicklung eines innovativen biotechnologischen Verfahrens zur Produktion hochwertiger Kohlenhydrate aus nachwachsenden Rohstoffen durch erstmaligen Einsatz des ext[…]

Projektdurchführung

Technische Universität Hamburg (TUHH) CBBS Center for Biobased Solutions
21073 Hamburg

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Aufgrund seines breiten Substratspektrums nimmt das thermoalkaliphile Bakterium Anaerobranca gottschalkii (vormals bogoriae) eine Sonderstellung unter allen extremophilen Mikroorganismen ein und verfügt über eine Fülle von biotechnologisch interessanten Enzymen. Ziel des Projekts war es, durch den Einsatz von Biokatalysatoren aus diesem Mikroorganismus nachwachsende Rohstoffe wie Stärke bzw. Amylopectin und Amylose zu hochwertigen Kohlenhydraten (Cyclodextrine, verzweigte Dextrine und Oligosaccharide) umzusetzen.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDas Genom des thermoalkaliphilen Bakteriums Anaerobranca gottschalkii wurde zunächst partiell sequenziert. Ziel des Teilprojekts war es, unter geringst möglichem Aufwand und innerhalb kürzester Zeit alle oder möglichst viele Gene des Kohlenhydratstoffwechsels zu identifizieren. Die partielle Genomanalyse erfolgte über eine so genannte shotgun-Seqenzierung. Dabei wurde die genomische DNA mechanisch geschert, kloniert und an den Fragmentenden sequenziert. In 14.865 Sequenzierungsansätzen wurden 11.634 brauchbare Sequenzen mit einer Rohsequenz von 11,97 Mbp generiert. Die produzierten Sequenzfragmente wurden in einer Datenbank zusammengefasst und assembliert. Anschließend erfolgte die bioinformatische Auswertung über eine automatisch vorgenommene und manuell nachbearbeitete Annotation. Sequenzlücken in biotechnologisch relevanten Genen wurden durch Primerwalking geschlossen. Den Projektteilnehmern wurden Passwortgeschützte Zugangsrechte auf den die Sequenzinformationen enthaltenen Server eingerichtet. Mit Hilfe dieser Sequenzinformation wurden Gene ausgewählter Kohlenhydrat-metabolisierender Gene kloniert und exprimiert und die rekombinanten Enzyme gereinigt. Die Substrat- und Produktspektren dieser Enzyme wurden mittels HPLC, High performance anion exchange chromatography (HPAEC), Dünnschichtchromatographie (DC) und size exclusion chromatography (SEC) charakterisiert. Um die Thermostabilität der CGTase zu erhöhen, wurden über Errorprone PCR Mutationen in das die CGTase kodierende Gen eingeführt und die mutierten Gene anschließend über DNA-shuffling neu rekombiniert. Die Gen-bank erhaltener, mutierter CGTase-Varianten wurde auf erhöhte Thermostabilität gescreent. Zur Abschätzung der Thermostabilität wurde die Schmelztemperatur verschiedener Mutanten mittels differential scanning calorimetry (DSC) bestimmt. Des Weiteren wurde ein System zur Tat-abhängigen heterologen, sekretorischen Expression etabliert. Dies geschah über die Herstellung von Fusionsgenen aus biotech-nologisch interessanten Genen von A. gottschalkii und verschiedenen Signalsequenzen.


Ergebnisse und Diskussion

Das Genom von Anaerobranca gottschalkii wurde sequenziert. Die 12.355 generierten guten Sequenzen sind in 510 Contigs assembliert. Die Gesamtlänge dieser Contigs beträgt 1.921.832 bp mit einer Qualität von PHRED 38 (entspricht einem zu erwartenden Sequenzfahler in ca. 8.000 bp). Es wurden ca. 95 % des Genoms bei 3,7-facher Sequenzabdeckung sequenziert. In der letzten Annotationsrunde wurden 1.956 Orf identifiziert. 1541 (78 %) der potenziellen Gene wiesen Homologien zu bereits bekannten Ge-nen auf. Unter ihnen fanden sich 593 potenzielle Membranproteine und insgesamt 93 Gene des Zuckermetabolismus. Mit Hilfe der Sequenzinformationen konnten zwei a-Amylasen, die CGTase, das Verzweigungsenzym und die Pullulanase in E.coli bzw. Staphylococcus carnosus aktiv in aktiver Form exprimiert und gereinigt werden. Mit verschiedenen Methoden wurden die rekombinanten Enzyme charakterisiert. Ebenfalls erfolgreich war die Konstruktion von Fusionsgenen aus den Genen für das Ver-zweigungsenzym bzw. die CGTase und verschiedenen Sekretions-Signalsequenzen. Nach Transformationen der Fusionsgene in Staphylococcus carnosus konnte im Überstand die jeweilige enzymatische Aktivitäten detektiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte daher erstmals in einem Grampositiven Bakterium ein Tatabhängiges Expressionssystem zur sekretorischen Gewinnung von rekombinanten Enzymen etabliert werden.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

VeröffentlichungenAntranikian, G., Klenk, H-P., Freudl, R., Sterner, R., Liebl, W. (2001): Extremophile Mikroorganismen als Quelle stabiler Biokatalysatoren. In: Heiden, S., Erb, R. (eds) Biokatalyse Sonderausgabe BIOspektrum and Spektrum Akademischer Verlag, 44-48.
Ballschmiter, M., Armbrecht, M., Ivanova, K., Liebl, W. (2004): Recombinant production and properties of two a-amylases from Anaerobranca gottschalkii.
Bertoldo, C., Armbrecht, M., Becker, F., Schäfer, T., Antranikian, G., Liebl, W. (2003): Cloning, sequencing and characterization of thermoalkalistable pullulanase type I from Anaerobranca gottschalkii.
Blaudeck, N., Sprenger G. A., Freudl, R., Wiegert, T. (2001): Specificity of signal peptide recognition in Tatdependent bacterial protein translocation. J.Bacteriol. 183, 604-610.
Biwer, A., Antranikian, G., Heinzle, E. (2002). Enzymatic production of cyclodextrins. Appl. Microbiol. Biotechnol., 59, 609-617.
Dilsen, S., Paul, W., Sandgathe, A., Tippe, D., Freudl, R., Thömmes, J., Kula, M.-R., Takors, R., Wandrey, C., Weuster-Botz, D. (2000): Fed-batch production of recombinant human calcitonin precursor fusion protein using Staphylococcus carnosus as an expression-secretion system. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54, 361-359.
Dilsen, S., Paul, W., Herforth, D., Sandgathe, A., Altenbach-Rehm, J., Freudl, R., Wandrey, C., Weuster-Botz, D. (2001): Evaluation of parallel operated small-scale bubble columns for microbial process development using Staphylococcus carnosus. J.Biotechnol. 88, 77-84.
Liebl, W. (2002): Extremophile: Mikroorganismen unter Extrembedingungen. Georgia Augusta 1:98-103.
Prowe, S. G., Antranikian G. (2001): Anaerobranca gottschalkii sp. nov., a novel thermoalkaliphilic bacterium that grows anaerobically at high pH and temperature. Int. J. Syt. Bacteriol. 45, 457-465.
Sandgathe, A., Tippe, D., Dilsen, S., Meens, J., Halfar, M., Weuster-Botz, D., Freudl, R., Thömmes, J., Kula, M. R. (2003): Prodution of a human calcitonin precursor with Staphylococcus carnosus: secretory expression and single-step recovery by expanded bed adsorption. Process Biochemistry, 38, 1351 - 1361.
Sterner, R., Liebl, W. (2001): Thermophilic adaptation of proteins. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 36, 39-106.
Thiemann, V., Antranikian, G., Klenk, H.-P., Vollstedt, A., Freudl, R., Jürgens, C., Sterner, R, Liebl, W. (2003): Das thermoalkaliphile Bakterium Anaerobranca gottschalkii als Quelle stabiler Enzyme zur Herstellung hochwertiger Kohlenhydrate. Transkript (Sonderheft Nachhaltige Biokatalyse Heiden, S., Erb, R., Eds.), pp.90 - 93.
Präsentationen
Ballschmiter, M., Ivanova, K., Antranikian, G., Liebl, W. (2002): a-amylases from the thermoalkaliphilic bacterium Anaerobranca gottschalkii. Poster, biocat2002, Hamburg, 28.-31.07.2002.
Bertoldo, C., Liebl, W., Armbrecht, M., Duffner, F., Schäfer, T., Antranikian, G. (2002): Purification and characterization of a thermoalkalistable pullulanase type I from the thermophilic anaerobic bacterium Anaerobranca gottschalkii after cloning and expression of its gene in Escherichia coli. Poster, bio-cat2002, Hamburg, 28.-31.07.2002 and 4th International Congress on Extremophiles, Neapel, 22.-26.09.2002.
Jürgens, C., Prowe, S.G., Thiemann, V., Sterner, R., Antranikian, G. (2003): Purification and characterisation of the native and the heterologously expressed CGTase from the anaerobic thermoalkaliphile Anaerobranca gottschalkii, VAAM Tagung Berlin, 23.-26.03.2003 und 5th Carbohydrate Bioengineering Meeting, Groningen, 06.-09.04.2003.
Klenk, H.-P.: Comparative genomics and evolution of extremophiles @ Extremophiles III. Hamburg, September 2000 und Whole genome comparisons @ International Conference on Structural Genomics. Yokohama, November 2000.
Thiemann, V., Vollstedt, A., Freudl, R., Reisen, M., Saake, B., Puls, J., Antranikian, G. (2002 und 2003): Purification and characterization of the heterologously expressed branching enzyme from the thermoal-kaliphilic bacterium Anaerobranca gottschalkii. Vortrag VAAM Tagung Göttingen, 24.-27.04.2002 und Poster biocat2002, Hamburg, 28-31.07.2002, VAAM Tagung Berlin, 23.-26.03.2003 und 5th Carbohydrate Bioengineering Meeting. Groningen, 06.-09.04.2003.


Fazit

Die Meilensteine des Projekts konnten erfolgreich erarbeitet werden. Der wissenschaftliche Output kann wie folgt zusammengefasst werden:
o 11 Publikationen (davon 8 mit gutachterlicher Praxis)
o 2 geplante Publikationen
o 5 Präsentationen auf hochkarätigen Veranstaltungen
o 3 Dissertationen
o 2 erteilte Patente