Projekt 13030/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: Biotechnologische Nutzung der Isoprensynthese phototropher Organismen

Projektdurchführung

Fraunhofer-Institut für AtmosphärischeUmweltforschung (IFU)
Kreuzeckbahnstr. 19
82467 Garmisch-Partenkirchen

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Als ungesättigter kurzkettiger Kohlenwasserstoff ist Isopren ein begehrter Rohstoff der Kunststoff- und Kautschukindustrie. Es ist nur zu sehr geringem Anteil im Erdöl enthalten und wird derzeit aufwendig aus dem C5-Schnitt der Raffinerien hergestellt. Ziel des geplanten Projekts ist, die Gene für die Isoprensynthese aus Laubbäumen und Cyanobakterien zu isolieren und in Bakterien zu exprimieren, um über die Expression der eingebrachten Isoprensynthesegene zu einer kostengünstigen, ressourcenschonenden biotechnologischen Produktion dieser Verbindung im Großfermenter zu gelangen.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenFür die Isolierung des Isoprensynthesegens wurde in dem Projekt zusätzlich zu den bereits im Labor vorhandenen cDNA-lambda-Genbanken der Isopren produzierenden Stieleiche (Quercus robur L.) und der Hybridpappel (Populus alba x P. tremula) eine genomische Genbank aus dem ebenfalls Isopren produzierenden Cyanobakterium Anacystis nidulans in Cosmiden erstellt. In der Cyanobakterien-Cosmid-Genbank konnten die Gene der Eingangsenzyme (dxs, dxr) der Isoprenoidsynthese nach Amplifikation eines Segments mittels PCR über DNA-Hybridisierung identifiziert und isoliert werden. Durch deren Klonierung und anschließender Expression wurde ein E.coli-Stamm konstruiert, in dem die Konzentration der Vorstufe (DMADP) 7-fach gegenüber dem Wildstamm erhöht war. Auf der Basis eines aus cDNA eines Hybridpappelblatts erhaltenen PCR-Segments konnte das komplette Gen in der lambda-cDNA-Bank der Pappel über Hybridisierung identifiziert werden. Nach Klonierung und Expression des Gens in den DMADP überproduzierenden E.coli-Stamm wurde ein Klon isoliert, der gegenüber dem Wildtyp 400 mal mehr Isopren in den Gasraum der Kultur freisetzt und der sich so für die Entwicklung eines biotechnologischen Isoprenproduktionsverfahrens eignet.


Ergebnisse und Diskussion

Mit dem Ziel, die Bildungsrate der Vorstufen der Isoprenoidsynthese in dem für die geplante biotechnologische Isoprenproduktion geeigneten Bakterienstamm zu erhöhen, wurde im Rahmen des Projekts eine Cosmid-Genbank aus dem Cyanobakterium Synechococcus leopoliensis erstellt. Mittels PCR konnte mit spezifischen Oligonukleotidprimern für die Gene der Eingangsenzyme der Isoprenoidbiosynthese (dxs, dxr) jeweils ein Segment dieser Gene amplifiziert werden. Mit Hilfe dieser Amplifikate wurde jeweils ein Cosmid der Genbank identifiziert, das das dxs-Gen bzw. das dxr-Gen als Bestandteil eines Operons trug. Die beiden Gene wurden jeweils hinter einen bakteriellen Promotor kloniert, und nach Expression in E.coli wurde in einem Funktionstest die Identität der Genprodukte eindeutig als die gesuchten Eingangsenzyme des Isoprenoidstoffwechsels nachgewiesen. Über das Einbringen des dxs-enthaltenden Plasmids konnte ein E.coli-Stamm bereitgestellt werden, der gegenüber dem Wildstamm eine 8-fach erhöhte Konzentration der Isopren-Vorstufe Dimethylallyldiphosphat besitzt. Einbringen des dxr-enthaltenden Plasmids führte zu keiner signifikanten Steigerung der Dimethylallyldiphosphatbildung. Um schließlich zu einem biotechnologisch verwertbaren Stamm zu gelangen, der auch das letzte Enzym in der Kette zur Isoprenbildung, die Isoprensynthase, enthält und damit bei seiner Anzucht große Mengen Isopren freisetzt, wurden eine Reihe von PCR-Experimenten mit cDNA der Hybridpappel unter Verwendung von abgeleiteten Primern von ansequenzierten Peptidfragmenten der Isoprensynthase durchgeführt. Auf dieser Basis gelang erstmalig die Amplifizierung eines Segments des Isoprensynthasegens. Über Hybridisierung konnte in der lambda-cDNA-Bank der Pappel ein Phage identifiziert werden, der das gesamte Gen der Isoprensynthase trug. Die Sequenzierung ergab, daß dieses Gen große Ähnlichkeit zu Monoterpensynthasen besaß und daß am 5-Ende eine für ein Signalpeptid kodierende Region vorhanden ist. Diese Region wurde entfernt und das verbleibende Gen hinter einen bakteriellen Promotor kloniert. Nach Expression des Gens zeigte das Genprodukt im Funktionstest wie erwartet eine deutliche Isoprensynthaseaktivität. Die Klonierung des Gens in den Stamm, der bereits das cyanobakterielle dxs-Gen exprimierte, führte zu einem Bakterienstamm, der gegenüber der rein chemischen Isoprenfreisetzung des Wildstamms ca. 400 mal mehr Isopren in den Gasraum der Kultur freisetzt und sich damit für eine biotechnologische Isoprenproduktion eignet.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Teile der Arbeit wurden publiziert unter:Miller B., Heuser T., Zimmer W. (1999) FEBS Letters 460: 485-490Miller B., Heuser T., Zimmer W. (2000) FEBS Letters 481: 221-226Miller B., Oschinski C., Zimmer W. (2001) Planta (angenommen)


Fazit

Das Projekt erzielte das gewünschte Ergebnis.