Projekt 13028/07

Förderschwerpunkt Biotechnologie: Verbund Sensorik in der Biotechnologie: Prozessintegrierter Umweltschutz in der biotechnologischen Produktion durch Online-Biosensor-Monitoring

Projektdurchführung

Eberhard-Karls-Universität TübingenInstitut für Physikalische und Theoretische Chemie
Auf der Morgenstelle 18
72076 Tübingen

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

In diesem Projekt soll ein optischer Biosensor zur markierungsfreien, produktspezifischen Überwachung von Fermentationsprozessen entwickelt werden. Ziel ist es, die bisher offline durchgeführte Analytik, bestehend aus Probennahme, Probenaufbereitungsschritten und einer geeigneten offline-Analyse, durch eine online-Überwachung zu ersetzen. Durch eine online-Überwachung kann der Prozess genauer gesteuert und schneller und einfacher auf Veränderungen im Prozess reagiert werden. So können Fehllaufzeiten vermieden und Abfallmengen und Energieverbrauch reduziert werden. Dies soll am Beispiel der Vancomycin- und der Hirudinproduktion vollzogen werden.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenFür das Monitoring werden in rasch aufeinanderfolgenden Zeitintervallen Proben aus dem Kulturmedium automatisch in die Detektionseinheit, die als Bypass realisiert wird, eingebracht. Es folgen schnelle Filtrations- bzw. Membranfiltrationsschritte, bevor die Probenlösung auf den eigentlichen Biosensor gebracht wird. Als Detektionsprinzip kommt die Reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS) zum Einsatz. Dazu muss in einem ersten Schritt ein geeigneter Transducer entwickelt werden, der spezifisch auf das zu detektierende Zielmolekül anspricht. Das entwickelte Detektorsystem soll zuerst mit reinen Standardlösungen charakterisiert werden. Anschließend sollen mit dem Detektionssystem reale Fermenterproben vermessen werden. Parallel dazu wird ein geeignetes Bypasssystem entwickelt, um die Detektionseinheit direkt am Fermenter anzubringen. Abschließend soll das Sensorsystem direkt an einem laufenden Fermentationsprozess zum Einsatz kommen und dort evaluiert werden.


Ergebnisse und Diskussion

Detektion von Vancomycin
Es konnte am Beispiel der Fermentation von Vancomycin gezeigt werden, dass mit dem an der Universität Tübingen entwickelten Sensorsystem eine online-Überwachung von Fermentationsprozessen prinzipiell möglich ist. Die Sensordaten lieferten dabei vergleichbare Werte wie die Referenzanalytik mittels HPLC. Es konnte erfolgreich ein referenzierter Aufbau entwickelt werden, der es ermöglicht, den spezifischen Anteil des Sensorsignals von unspezifischen Bindungsanteilen zu separieren. Dieses gelingt dadurch, dass simultan an zwei unterschiedlichen Messpunkten zum einen ein Gesamtsignal, zum anderen nur der unspezifische Anteil am Gesamtsignal gemessen wird. Da sowohl für die Sensormessung als auch für die Referenzanalytik zellfreie Proben benötigt werden, wurden bisher alle Proben zentrifugiert. Dieser Schritt der Probenvorbereitung konnte während dieses Projekts erfolgreich durch einen leicht zu automatisierenden Filtrationsschritt ersetzt werden. Ebenfalls gelang es, eine entsprechende Fluidik aufzubauen, die eine automatisierte Verdünnung der Proben um mehr als zwei Größenordnungen erlaubt und das Gesamtvolumen der verdünnten Proben deutlich unter 500 µl bleibt.
Detektion von Hirudin
Über ein indirektes Testformat konnte ein vielversprechender Ansatz für eine erfolgreiche Detektion von Hirudin gefunden werden.
Bewertung
Es konnte gezeigt werden, dass mit dem entwickelten Sensorsystem deutliche Einsparungen an Chemikalien und Zeit bezüglich der Analyse des Prozesses erreicht werden können. Auch bedeutet die Tatsache, dass bei der Detektion mit RIfS im wässrigen Milieu gearbeitet wird, eine erheblich qualitative Verbesserung der Arbeitsbedingungen für die Person, die die Analytik durchführt. Es kann auf gesundheitsschädliche Lösungsmittel wie Actonitrill, das zur klassischen Analyse mittels HPLC benötigt wird, verzichtet werden. Die Analysenzeiten für eine Einzelanalyse wurden beträchtlich reduziert. Somit ist die Analytik mit dem entwickelten Sensorsystem zeitnaher am Fermentationsprozess und es kann schneller auf ungewohnte Veränderungen im
Prozess reagiert werden.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Vorträge:
BioTechnica, Okt. 1999 (Hannover)
Dechema, Jan. 2000 (Frankfurt
)Lifecom, März 2000 (Düsseldorf)
Achema, Mai 2000 (Frankfurt)
Heiligenstadt, Oktober 2000
Terra-Tec, März 2001 (Leipzig)
Sensor 2001, Mai 2001 (Nürnberg
)Poster:
Prozessmesstechnik in der Biotechnologie, Mai 2000 (Bamberg)
Bio-Gen-Tec NRW, März 2001 (Köln)
Dechema Jahrestagung der Biotechnologen, März 2001 (Leipzig)
Biosensor 2001, April 2001 (Tübingen)
Pressemitteilung (Dez. 1999)
Beitrag für die Zeitschrift attempto! der Presseabteilung der Universität Tübingen, in Bearbeitung
Publikationen:
- Mehlmann, M., Tünnemann, R., Jung, G. & Gauglitz, G. (2001): Markierungsfreie Interaktionsanalyse zur online-Überwachung von Fermentationsprozessen mit Reflektometrischer Interferenzspektroskopie. In Erb, R. & Heiden, S. (Hrsg.) (2001): Sensorik, Sonderausgabe BIOSpektrum: 19-22.
- Tünnemann, R., Mehlmann, M., Süßmuth, R. D., Bühler, B., Pelzer, S., Wohlleben, W., Fiedler, H.-P., Wiesmüller, K.-H., Gauglitz, G. & Jung, G. (2001): Optical Biosensors - Monitoring studies of Glycopeptide Antibiotic Fermentation Using White Light Interference. Anal. Chemie 73: 4313-4318.


Fazit

Vancomycin konnte erfolgreich in realen Fermenterproben detektiert und der Fermentationsverlauf verfolgt werden. Von der apparativen Seite konnte erfolgreich ein System zur automatisierten Verdünnung aufgebaut und charakterisiert werden. Somit konnten alle Probenvorbereitungsschritte automatisiert werden.
Die Detektion von Hirudin konnte bisher nur prinzipiell gezeigt, aber noch nicht quantifiziert werden.