Projekt 12033/01

Entwicklung einer innovativen Fast-FISH (Fast Fluorescent In Situ Hybridization) Gensonden-Technik zur schnellen und quantitativen Identifizierung von Mikroorganismen in Kläranlagen und Umweltproben

Projektdurchführung

ATM Abwassertechnik
Akademiestr. 7
80799 München

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Die Belebtschlammbiozönose von Abwasserreinigungsanlagen kann mit klassischen Methoden nur unzureichend und stark fehlerbehaftet identifiziert werden. Die Kenntnis der mikrobiellen Populationen ist aber notwendig, um Störungen in dem Reinigungsverhalten einer Anlage konstruktiv beurteilen zu können und effektive Maßnahmen einzuleiten. Die FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) - Technik kann aufgrund des Einsatzes von 16S rRNA gerichteten, spezifischen Gensonden für eine schnelle und ge-naue Analyse der Belebtschlammbiozönose verwendet werden, konnte sich aber aufgrund ihrer schlechten Anwendbarkeit in der täglichen Praxis zur qualitativen und quantitativen Mikroorganismenbestimmung noch nicht durchsetzen. Aus diesem Grund soll in diesem Projekt eine neue und innovative Meßmethode entwickelt werden (Fast-FISH), welche die Vorteile der FISH-Technik nutzt und durch ihre Schnelligkeit und Automatisierbarkeit eine breite Anwendbarkeit in der Praxis ermöglicht.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Zielsetzungen für die erste Projektphase waren die Entwicklung der Fast-FISH-Technik und die Verifizierung anhand zahlreicher Vergleichsmessungen mit der FISH-Technik. Hierbei sollte besonders darauf geachtet werden, eine möglichst praxisrelevante, d.h. kostensparende und umweltschonende Arbeitsanweisung zu entwickeln, um einen späteren Einsatz in der Praxis zu ermöglichen. Der Einsatz eines an der TU München bestehenden umfassenden Gensondensatzes soll die Anwendbarkeit der Technik auch für die Detektion ungewöhnlicher Bakteriengruppen garantieren.

In der zweiten Projektphase sollte die Anwendbarkeit der Fast-FISH Technik unter Beweis gestellt und letztere den bestehenden Anforderungen angepaßt werden. Konkrete Fragestellungen aus der Praxis sollten aufgegriffen und mit Hilfe der entwickelten Meßmethode untersucht werden. Kinetische Untersuchungen zum Nährstoffabbau, zu Kapazitätsberechnungen sowie physikalische Bestimmungen sollten mit den mikrobiologischen Daten verglichen und ausgewertet werden. Der Einsatz vor Ort auf unter-schiedlichen Kläranlagen mit verschiedenen Betriebsstörungen sollte die Praxistauglichkeit der Fast-FISH-Methode beweisen.


Ergebnisse und Diskussion

Der Schwerpunkt der ersten Projektphase lag auf der Entwicklung der Fast-FISH-Technik. Bei dieser Technik sollen die spezifisch in den Bakterien hybridisierten fluoreszenzmarkierten Oligonukleotidsonden abgelöst und in einem geeigneten Auswertegerät quantifiziert werden. Als Auswerteeinheit wurden nach zahlreichen Sensitivitätstest ein Küvetten-Fluorometer ausgewählt. Nach der grundsätzlichen Etablie-rung der Methode wurden die optimalen Wellenlängen zur Vermessung verschiedener Fluoreszenzfarb-stoffe, die Sensitivität des Meßgeräts, sowie die Stabilität und Reproduzierbarkeit der Meßwerte ermit-telt. Simultane Fast-FISH-Hybridisierungen mit mehreren Oligonukleotidsonden wurden durchgeführt und evaluiert. Es wurde gezeigt, daß die Quantifizierung einzelner bakterieller Spezies in einem Ge-misch verschiedener Bakterienarten mittels der Fast-FISH Technik bereits erfolgreich durchgeführt wer-den kann. Um die Anwendungsmöglichkeit der Methode auch in Umweltproben zu demonstrieren, er-folgte exemplarisch die qualitative Analyse von Bakterien in einer künstlichen Mischung mit Belebtschlamm. Eine qualitative Aussage war mit Fast-FISH in derartigen Systemen bereits eindeutig möglich, die quantitative Anwendung von Fast-FISH bedurfte jedoch noch weiterer Optimierung.
In der zweiten Projektphase konnte das bestehende Protokoll der Fast-FISH-Methode durch die Änderung verschiedener Parameter noch wesentlich verbessert und optimiert werden. So konnte die zuverlässige Quantifizierung von den meisten in diesem Projekt untersuchten bakteriellen Gruppen erreicht werden. Eine Ausnahme bildeten Filamente, die mit verschiedenen enzymatischen Methoden aufge-schlossen werden müssen um für Gensonden durchlässig zu sein und nur einen sehr geringen Gehalt an ribosomaler RNA aufwiesen. Hier ist eine weitere Verbesserung der Technik notwendig. Um die Ergebnisse, die mit Hilfe der FISH- und der Fast-FISH-Technik bei der Analyse verschiedener Schlämme erzielt wurden, miteinander vergleichen zu können, wurde ein neuartiges Sondenkonzept entwickelt. Dieses ermöglicht zum ersten Mal, kultivierungsunabhängige mikrobielle Bestandsaufnahmen von Schlämmen mit der Gensondentechnologie durchzuführen und zuverlässig über einen längeren Zeitraum hinweg zu vergleichen und zu evaluieren. Basierend auf dem entwickelten Sondenkonzept wurden mittels der FISH- und der Fast-FISH-Technologie zahlreiche Messungen von Schlammproben kommunaler und industrieller Kläranlagen durchgeführt. Die gleichzeitige Anwendung beider Techniken ermöglichte zum einen den ständigen Abgleich der neu entwickelten Fast-FISH-Technik bezüglich der Zuverlässigkeit der Meßwerte und zum anderen auch die Messung von Filamenten die mittels der Fast-FISH-Technik nicht identifiziert werden konnten. Messungen über einen Zeitraum von über einem Jahr ermöglichten eine Bestandsaufnahme hinsichtlich der mikrobiellen Zusammensetzung und eine konkrete Bewertung der Qualität verschiedener belebter Schlämme.
Mit der Fast-FISH-Technologie steht nun erstmals eine Technik zur Verfügung mit der schnell und präzise bakterielle Populationen quantifiziert werden können. Mit Hilfe dieser Technologie ist es möglich Än-derungen in der bakteriellen Biozönose frühzeitig zu detektieren, bevor kostenintensive Störungen der Abwasserreinigungsanlage auftreten.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Die aus der Kooperation zwischen der TU München, Lehrstuhl für Mikrobiologie und der ATM hervorgegangene VERMICON AG, wird im Jahre 2001 ein Testkit auf dem Markt bringen, das - basierend auf der Fast-FISH-Technologie - für den Einsatz auf Kläranlagen zur Identifizierung und Quantifizierung mikrobieller Populationen entwickelt wurde.
Die Dokumentation in einschlägigen Fachzeitschriften wird angestrebt. Eine Präsentation der Ergebnisse erfolgte bereits im Rahmen von Messen (z.B. Biotechnica 1999, Analytica 2000) und über Fachvorträge (Seminar PTS München, ATV Landesgruppentagung Rosenheim 1999 u.a.).


Fazit

Das angestrebte Ziel, im ersten Jahr des Projekts die Methodik der Fast-FISH-Technik zur schnellen qualitativen und quantitativen Analyse von Mikroorganismen in Belebtschlammproben von Abwasserreinigungsanlagen zu entwickeln, konnte vollständig erreicht werden. Das Potential des Verfahrens konnte an realen Belebtschlammproben, denen die nachzuweisenden Bakterien künstlich beigemischt worden waren, bewiesen werden.
In der zweiten Projektphase konnte insbesondere durch eine Sensitivitätssteigerung der Fast-FISH-Gensonden-Technik das Detektionslimit verbessert werden. Es wurden Problemorganismen nachgewiesen und quantitativ erfaßt, die nur in geringen Mengen im Abwasser vorkommen. Dies wird eine schnelle Problemerfassung und eine frühzeitige Einleitung spezifischer Gegenmaßnahmen, auf die es in der Abwasserreinigungsindustrie in immer stärkerem Maße ankommt, ermöglichen. Durch konkrete Fragestellungen wurden hier, aufbauend auf den methodischen Erkenntnissen der ersten Projektphase, problemerkennende und problemlösende Konzepte formuliert und angewandt.