Projekt 11823/01

Entwicklung eines innovativen Nikotin-Metabolit-Assays zur Vermeidung des plötzlichen Kindstods (SIDS = sudden infant death syndrome) als Ersatz für umweltbelastende Analyseverfahren

Projektdurchführung

St. Josef-Hospital BochumUniversitätsklinik der Ruhr-Universität BochumKlinik für Kinder- und Jugendmedizin
Alexandrinenstr. 5
44791 Bochum

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Im Rahmen des Projektes soll ein Test etabliert und zur Marktreife gebracht werden, mit Hilfe dessen sich die individuelle Tabakexposition empfindlich, exakt, schnell und ohne apparativen Aufwand erfassen lässt. Eingesetzt werden soll dieser Test unter anderem bei Personen, die willens sind, sich einem Rauchentwöhnungsprogramm zu unterziehen, sowie für versicherungstechnische Fragestellungen. Insbesondere für die Kontrolle von Schwangeren sowie jungen Eltern ist dieses Testsystem von Relevanz, da allein bis zu zwei Drittel aller Fälle von plötzlichem Kindstod auf elterliches Rauchen zurückzuführen sind.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten Methoden· Synthese eines Cotinin-Konjugates;
· Entwicklung und Optimierung eines Assay zum quantitativen Nachweis von Cotinin unter Verwendung des bei der Firma BioTrend käuflichen anti-Cotinin-Antiserums vom Schaf;
· Entwicklung und Testung eines eigenen polyklonalen anti-Cotinin-Antiserums in Kaninchen und Aufbereitung von affinitätsgereinigten Antikörpern daraus;
· Weiterentwicklung des o.g Cotinin-Assay unter Verwendung dieses polyklonalen Antikörpers;
· Entwicklung und Testung eines eigenen monoklonalen anti-Cotinin-Antikörpers;
· Weiterentwicklung des o.g. Cotinin-Assay unter Verwendung des eigenen monoklonalen Antikörpers;
· Auswahl der optimalen Assay-Variante nach Sensitivität, Spezifität, Präzision, Wiederfindungsraten, Matrix-Effekten etc.;
· Validierung des Assay zunächst gegenüber einem Fragebogen zur Tabakexposition;
· Validierung des Assay für Urin und Mekonium durch Vergleich mit konventioneller aufwendiger HPLC-Methode.


Ergebnisse und Diskussion

· In der ersten Version des Abicap®-Cotinin-Assay wurden die Mekonium- und Urinproben mit unbekannter Cotinin-Konzentration mit einer definierten Menge BSA-Cotinin-Biotin-Konjugat vorinkubiert, um beide dann miteinander um die Bindung an den affinitätsgereinigten anti-Cotinin-Antikörper aus dem Antiserum der Fa. BioTrend konkurrieren zu lassen. Das Gemisch der so entstandenen Komplexe wurde in einer zuvor mit Anti-Schaf-IgG-Antikörper beschichtete Abicap®-Säule zurückgehalten. Abicap® Red wurde zugegeben und der durch BSA-Cotinin-Biotin-Konjugat induzierte Farbumschlag im Abicap® Reader quantifiziert. Damit korrelierte die Farbreaktion mit dem gebundenen BSA-Cotinin-Biotin-Konjugat-Komplex und war entsprechend indirekt proportional zur Cotininmenge der Probe. Eine Quantifizierung war durch Vergleich mit Standards möglich. Dieses Testprotokoll wurde sukzessive bzgl. der verschiedenen Konzentrationen und Inkubationszeiten opti-miert.
· Zur Produktion polyklonaler Antikörper wurde Kaninchen ein Hämocyanin-Cotinin-Konjugat mehrfach verabreicht. Aus dem Serum der Tiere ließen sich ausreichende Antikörpermengen isolieren. Die Affinität der so gewonnenen Antikörper war nicht höher als die des kommerziell erhältlichen Antikörpers. Daher wurden das Ziel der Produktion eines eigenen polyklonalen Antikörpers nicht weiter verfolgt.
· Die Produktion eines eigenen monoklonalen anti-Cotinin-Antikörpers bzgl. Antikörper-Konzentration und -Menge wurde in mehreren Schritten durch Immunisierung von jeweils 5 Mäusen mit verschiedenen Cotinin-Konjugaten optimiert. Letztendlich ließ sich bei einer Konzentration von 100 ng/ml eine ca. 75%ige Inhibition erzielen.
· In einer weiteren Version des Abicap®-Cotinin-Assay wurde daher die Fritte nicht mit Anti-Schaf-IgG-Antikörper, sondern mit einem Schaf-Antikörper gegen Maus-IgG beschichtet, und die Vorinku-bation erfolgte mit dem eigenen monoklonalen anti-Cotinin-Antikörper. Ansonsten waren, wie umfangreiche Erprobungen ergaben, Änderungen des Testprotokolls nicht notwendig.
· Letztendlich fiel u.a. wegen des Preisvorteils die Entscheidung für diese letztgenannte Testvariante. Die untere Detektionsgrenze liegt im Bereich von 200 ng/ml, die obere bei ca. 12800 ng/ml. Urinpro-ben von Rauchern- und Nichtrauchern können damit ebenso wie die von starken und mäßigen Rauchern unterschieden werden. Für die Diskriminierung von Nicht- und Passivrauchern reicht die Empfindlichkeit des Tests nicht aus. Unerwartete Schwierigkeiten, die als Matrix-Effekte identifiziert werden konnten, traten bei der Anwendung an Mekoniumproben auf. Der Test ist für Mekoniumproben von intrauterin tabakexponierten Neugeborenen nicht geeignet. Hier bietet das herkömmliche Ver-fahren, die HPLC-Methode Vorteile. Zusammenfassend erwiesen sich die vorgesehenen Arbeiten in einem wesentlichen Teil als prinzipiell durchführbar und wurden fristgerecht abgeschlossen.
· Nach der Einsicht, dass der Test für Mekoniumproben ungeeignet ist, wurden im Laufe des Projektes zusätzliche Aktivitäten auf die Durchführung einer größeren Studie zur Rauchentwöhnung konzentriert, die noch andauert. Hierzu wird eine Wiederholung der Probensammlung nach ca. 3 Monaten zur Überprüfung des Erfolgs einer Empfehlung zur Beendigung des Rauchens durchgeführt.
· Bei der Zusammenarbeit mit den Kooperationspartnern traten keine Probleme auf.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Die Ergebnisse scheinen zur Publikation sowohl in einer wissenschaftlichen Zeitschrift als auch in der Laienpresse geeignet.
Es ist vorgesehen, den Abicap®-Cotinin-Assay kommerziell verfügbar zu machen und so Ärzten, Apothekern und Laien ein schnelles, kostengünstiges und dennoch präzises Werkzeug für Urinproben zur Quantifizierung der individuellen Tabakexposition bereitzustellen. Dieses Werkzeug soll unterstützend in der Reduktion des Tabakkonsums und dessen Folgen eingesetzt werden. Anwendungsgebiete sollen der Einsatz in Rauchentwöhnungsprogrammen, insbesondere bei jungen Müttern, sowie bei arbeitsmedizinischen (MAK-Konzentrationen) und versicherungstechnischen (Nichtraucherbonus im Versicherungsbeitrag) Fragestellungen sein.


Fazit

Die vorgestellte Methode hat sich bei der Anwendung an Urinproben als effiziente Alternative zu den herkömmlichen, umweltbelastenden und kostenaufwendigen Analyseverfahren bewährt und kann somit in einem nächsten Schritt unbedenklich einem breiten Anwenderfeld zugänglich gemacht werden.
Für Mekoniumproben bestehen keine Vorteile gegenüber der HPLC-Methode.