Projekt 10974/01

Entwicklung und Anwendung eines automatisierten Biosensorsystems zur kontinuierlichen Online-Messung der biologischen Toxizität von Oberflächenwasser, Abwasser und Deponiesickerwasser

Projektdurchführung

IKA LabortechnikJanke & Kunkel GmbH & Co. KG
79217 Staufen

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Die Beurteilung der biologischen Toxizität zur Kontrolle von Oberflächen- und Abwasser mit einfachen und automatisierten Testsystemen gewinnt zunehmend an Bedeutung. Die Untersuchung der biologischen Toxizität als Umweltparameter mit universeller Einsetzbarkeit kann einfach durch die Messung der mikrobiellen Stoffwechselaktivität von Testorganismen erfolgen. Ziel der Vorphase war die Weiterentwicklung des bestehenden Biosensors zur Detektion mikrobieller Stoffwechselaktivität über den Energiemetaboliten ATP und bestimmte Testorganismen auf ihre Anwendbarkeit bei unterschiedlichen Messproblemen auszuwählen und auf ihre Eignung zu untersuchen.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenZunächst wurde die Auswahl der Organismen getroffen und ihre Eignung als Testorganismen für die Bestimmung der biologischen Toxizität überprüft. Dabei wurde insbesondere die DIN 38412 zur Bestimmung der biologischen Toxizität berücksichtigt. Die ausgewählten Testorganismen waren Pseudomonas putida, Saccharomyces cerevisiae und Escherichia coli K12 und weitere Mikroorganismen (Klärwerksproben). Durch vergleichende Untersuchungen mit den etablierten Methoden der Trübungsmessung, Bestimmung der Kolonie-bildenden Einheiten und Atmungsmessungen wurde die Aussagekraft der biosensorischen ATP-Bestimmung für Stoffwechselaktivität und Wachstum untersucht. Die für diesen Zweck ausgewählten Referenztoxine waren Zinksulfat, Kaliumdichromat und Dichlorphenol. Außerdem wurde die Handhabung der Mikroorganismen bezüglich Bevorratung/Fermentierung im Bioreaktor und der notwendigen Inkubationsdauer mit der Probe untersucht. Die Effizienz des erforderlichen Zellaufschlusses zur Bestimmung des intrazellulären ATP-Gehaltes und die Aussagekraft des Detektionssignals wurden überprüft. Der Laboraufbau des Sensorsystems mit den Funktionskomponenten Inkubation, Zellaufschluss und Detektion wurde im Hinblick auf Analysegeschwindigkeit, Stoffströme und Haltbarkeit der Enzymkomponente des Fließ-Infektions-Analyse-(FIA)Systems für eine zuverlässige Handhabung weiterentwickelt und mit einer Rechnersteuerung ausgestattet.


Ergebnisse und Diskussion

Die anwendungsrelevanten Untersuchungen eines Biosensors bestehen naturgegeben aus der biologisch/biochemischen und der technischen Komponente.

Biologisch/biochemische Komponente
Die Überprüfung, ob in den ausgewählten Testorganismen ATP gemessen werden kann und ob die Bestimmung von ATP im Vergleich mit den etablierten Methoden der Trübungsmessung (OD), der Atmungsmessung und der Bestimmung der koloniebildenden Einheiten (KBE) eine geeignete Methode zur Erfassung der biologischen Toxizität darstellt, ergab folgende Ergebnisse:

1. ATP ist bei allen o.g. Organismen und bei Ustilago maydis, Bacillus stearothermophilus TP32, Micrococcus luteus und Mischkulturen wie Belebtschlamm gut messbar und liefert auch im Hinblick auf die etablierten Methoden gleichwertige und z.T. noch aussagekräftigere Ergebnisse. Es konnte gezeigt werden, dass der für die ATP-Freisetzung erforderliche vollständige Zellaufschluss von gleichbleibend hoher Qualität ist.

2. Bei Bakterien kann eine Vergiftung schneller nachgewiesen werden als bei Hefen.

3. Reaktorkultivierungen zeigen während der exponentiellen Phase der OD auch ein exponentielles Ansteigen von ATP.

Technische Komponenten
Die Hauptkriterien für die Realisierung des ATP-Biosensorsystems sind die Detektionszuverlässigkeit, die Signal-Sensitivität, die Förderströme im FIA-System und eine möglichst kleine Zeitspanne bis zum Messergebnis. Nur wenn die Vergiftung der Testkultur frühzeitig festgestellt werden kann, ist es möglich, die schädlichen Auswirkungen auf die Umwelt zu begrenzen. Deshalb wurde eine neue Messzelle mit Hinterspülung entwickelt und versucht, den Messwert mittels alternativer Auswerteverfahren schnell zu erkennen. Testfermentationen dienten der Überprüfung der verschiedenen Kultivierungsphasen für Toxizitätsmessungen. Als Ergebnisse konnte festgestellt werden:

4. Das Mischungsverhalten und der Verbrauch an Reagenzien wurde durch Untersuchungen der Förderströme optimiert.

5. Die neue Messzelle mit Hinterspülung bewirkt eine Halbierung des Intervalls zwischen zwei Messungen auf etwa 20-25 min.

6. Zwischen den Messgrößen Plateauhöhe, Anfangssteigung und dem Integral über 3 min kann eine Beziehung hergestellt werden, die eine frühzeitige Ergebnisdarstellung ermöglicht.

7. Für die Stabilität des immobilvisierten Luciferase-Enzyms ist es wichtig, dass der Messkopf gekühlt wird. Dadurch lässt sich die Standzeit einer Membran auf etwa einen Monat verlängern. Die Reaktionszeit wird durch die Kühlung praktisch nicht verlängert.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Das System wurde auf der DECHEMA Jahrestagung 1997 und der ACHEMA 1997 mit großer Resonanz präsentiert.


Fazit

Im Verlauf des Projektes wurde ATP bei den im Antrag genannten Organismen gemessen und bei mehreren Mikroorganismen die hohe Aussagekraft des Stoffwechselsignals für die Wirkung verschiedener Toxine belegt. Zusätzlich wurde ATP bei einer Kultur von Bacillus stearothermophilus TP 32, Micrococcus luteus und Ustilago maydis sowie einer Mischkultur von Belebtschlamm aus der örtlichen Kläranlage in Donaueschingen nachgewiesen. Der Vielzahl und Unterschiedlichkeit der Organismen, an denen ATP gemessen werden konnte, zeigt, dass ATP ein universell messbares Signal für die Stoffwechselaktivität von Organismen ist und dass das weiterentwickelte Biosensorsystem direkt breit eingesetzt werden kann.