Projekt 09764/01

Nutzung der Biosensortechnik für physiologische Untersuchungen und Entwicklung eines BSB-Sensors am Beispiel der Hefe Arxula adeninivorans

Projektdurchführung

Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK)
06466 Gatersleben

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Ziel des Projekts ist es, zur Messung von Abwasserbelastungen einen BSB-Sensor auf der Basis der Hefe Arxula adeninivorans LS3 zu entwickeln. Diese Hefe ist hinsichtlich Substratspektrum dem derzeitig kommerziell eingesetzten BSB-Sensor überlegen und ermöglicht damit eine bessere Übereinstimmung mit dem BSB5.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenVor dem endgültigen Einsatz dieses Sensors sind noch einige Grundlagenuntersuchungen zur Physiologie und Kultivierung als auch Langzeituntersuchungen zur Applikation notwendig, deren Bearbeitung innerhalb des hier geförderten Projekts angestrebt wird. So sind aufbauend auf den bisher erzielten Ergebnissen in den nächsten 2,5 Jahren folgende physiologische Grundfragen abzuklären:
- Substratinduktion und Optimierung der Kultivierung;
- Glyzerinempfindlichkeit;
- Induktion/Aktivierung der Aufnahme und des Abbaus von Disacchariden;
- Induktion/Aktivierung der Aufnahme und des Abbaus von Aminosäuren und Oligopeptiden;
- Einfluss von Temperatur und Salz auf die Immobilisierung und Substratspezifität.
Die sich anschließenden Applikationsuntersuchungen sollen zu folgenden Schwerpunkten erfolgen:
- Abwasserempfindlichkeit/Übereinstimmung mit dem BSB5 Wert;
- Messzeit; Messroutine (kinetische bzw. stationäre Messung); Messbereich; Messfrequenz (Beeinflussung der Leistungsparameter);
- Langzeitstabilität; Immobilisierung; Lagerstabilität.
Aufgrund der schnellen Testung verwertbarer Substratspektren sowie der Wechselwirkungen verschiedener Substrate ergeben sich außerdem neue effektive Möglichkeiten für physiologische Untersuchungen bei Arxula-Mutanten und -Transformanten mit Hilfe der Sensortechnik. Derartige Charakterisierungen sollen ebenfalls Gegenstand des Projekts sein. Damit kann für die Biosensortechnik ein weiteres Anwendungsfeld erschlossen werden.


Ergebnisse und Diskussion

Im Rahmen dieses Projekts konnte bisher erstmals gezeigt werden, dass sowohl Zellkultivierung als auch das dazu genutzte Medium die Sensor-Signale beeinflussen. So lassen sich bei Einsatz von Malto-se anstelle von Glucose als C-Quelle mit diesen A. adeninivorans-Zellen das Spektrum messbarer Sub-strate vergrößern und meist höhere Sensor-Signale erzielen. Auch die Messtemperatur der Messkammer des ARAS SensorBOD-Systems der Dr. Bruno Lange GmbH war bisher für den Arxula-Sensor noch nicht optimal. So lässt sich durch Erhöhung der Temperatur von 37°C auf 40°C/42°C die Sensitivität des Biosensors auf die meisten Substrate steigern. Noch entscheidender ist der Einfluss der Morphologie der als Biosensorkomponente genutzten A. adeninivorans Zellen auf die erreichbaren Sensor-Signale. Da diese Hefe eine dimorphe Hefe ist, die bei Kultivierungstemperaturen unter 42°C Hefezellen bildet und ab 43°C als Mycel wächst, bestand erstmals die Möglichkeit, zwei unterschiedliche morphologische Formen eines Stamms als mikrobielle Sensorkomponente zu testen. Dabei konnten durch die Nutzung von Mycel die Sensor-Signale der meisten getesteten Substanzen erhöht werden, ohne Verringerung der Messbereiche, der Lagerstabilität bzw. der Anzahl der Messungen, die mit solch einem Sensor durchgeführt werden können. Keinen bzw. nur einen geringen Einfluss auf die Sensor-Signale haben die zur Immobilisierung genutzten Substanzen.
Da A. adeninivorans eine osmoresistente Hefe ist, wurde ihr Einsatz zur Messung von Umweltbelastungen in Salz-, Meeres- und Brackwasser getestet. Während es bei herkömmlichen Biosensoren bereits bei sehr geringen Salzkonzentrationen zu physiologischen Veränderungen des Biosensors kommt, konnte beim Arxula-Biosensor bis zu einer NaCl-Konzentration von 0,5 % (entspricht 10 % NaCl in der Messprobe) nur der durch die veränderte Sauerstofflöslichkeit hervorgerufene physikalische Effekt bestimmt werden. Erst höhere NaCl-Konzentrationen verursachen auch bei diesem Biosensor physiologische Effekte, die zur Veränderung der Sensor-Signale führen. Bei Nutzung von Hefeextrakt konnte ge-zeigt werden, dass der durch die NaCl-Zugabe verursachte physiologische Effekt sehr stark von der Konzentration des Substrats abhängig ist. So korrelieren bei dem Arxula-Biosensor Hefeextraktkonzentrationen bis zu 0,0625 % (entspricht 0,5 % in der Messprobe) direkt mit der NaCl-Konzentration, wobei bis zu dieser NaCl-Konzentration nur der physikalische Effekt nachweisbar ist.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Publikationen
Riedel K., Lehmann M., Tag K., Renneberg R., Kunze G (1998): Arxula adeninivorans based sensor for the estimation of BOD. Anal. Lett. 31, 1-12.
Tag K., Lehmann M., Chan C., Renneberg R., Riedel K., Kunze G. (1998): Arxula adeninivorans LS3 as a suitable biosensor for measurements of biodegradable substances in salt water. J.Chem.Technol. Biotechnol. 73, 385-388.
Chan C., Lehmann M., Tag K., Lung M., Kunze G., Riedel K., Gruendig G., Renneberg R. (1999): Measurement of biodegradable substances using the salt-tolerant yeast Arxula adeninivorans for a microbial sensor immobilized with poly(carbamoyl)sulfonate (PCS): Part I: Construction and characterization of the microbial sensor. Biosensors & Bioelectronics.
Lehmann M., Chan C., Lo A., Lung M., Tag K., Kunze G., Riedel K., Renneberg R. (1999): Measurement of biodegradable substances using the salt-tolerant yeast Arxula adeninivorans for a microbial sensor immobilized with Poly(carbamoyl)sulfonate (PCS). Part II: Application of the novel biosensor for real samples from coastal and island regions. Biosensors & Bioelectronics.
Vorträge (V), Poster (P) und Messepräsentationen (M)
Tag K: Rapid measurements of biodegradable substances in water using a sensor based on the yeast Arxula adeninivorans. Hong Kong University of Science and Technology, Hong Kong, 8.12.1998 (V).
Tag K., Lehmann M., Riedel K., Renneberg R., Kunze G.: Arxula adeninivorans based sensor for the estimation of biochemical oxygen demand (BOD). VAAM-Frühjahrstagung, Frankfurt/Main, 22.-26.4.1998 (P).
Neuartige Biosensoren zur Messung des Biochemischen Sauerstoffbedarfs (BSB) und von Kupferionen. Hannover-Messe, 20.-25.4.1998 (M).


Fazit

Durch eine veränderte Kultivierung der Arxula-Zellen (Maltose statt Glucose als C-Quelle), die Erhöhung der Messtemperatur auf 40°C/42°C und die Nutzung von Arxula-Mycelien statt Hefezellen lässt sich die Sensitivität des Arxula-Sensors weiter steigern. Außerdem konnte mit den bisherigen Untersuchungen erstmals gezeigt werden, dass der Arxula-Sensor auch zur Messung von Umweltbelastungen in Salz-, Meeres und Brackwasser geeignet ist.