Projekt 07833/01

Entwicklung und Anwendung miniaturisierter automatisierter Testverfahren zur humantoxikologischen und ökotoxikologischen Bewertung von Schadstoffen in Umweltproben

Projektdurchführung

Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule (RWTH) Aachen Institut für Hygiene und Umweltmedizin
Pauwelsstr. 30
52057 Aachen

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Bereitstellung standardisierter automatisierter Testmethoden zur Bestimmung der Ökotoxizität, der Mutagenität und Genotoxizität sowie der Humantoxizität von Schadstoffen in Umweltproben. Bestehende Testverfahren sollen durch neue Verfahren ergänzt und erweitert sowie in miniaturisierte Form, d.h. in einen Mikrotiterplattenmaßstab, überführt werden. Dies soll zukünftig eine kostengünstige Testung großer Probenzahlen ermöglichen. Die Testsysteme sollen von Endpunktmessungen auf kinetische Datenaufnahme durch kontinuierliche Messung umgestellt werden. Dies ermöglicht eine wesentliche Steigerung von Aussagefähigkeit, Testempfindlichkeit und -sicherheit.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Bestimmung der methodischen Grenzen und Möglichkeiten zur Miniaturisierung und Automatisierung ausgewählter Biotestverfahren erfolgt durch direkten Vergleich mit bereits etablierten Makrotests. Ausgewählte Biotestsysteme sind z.B. Leuchtbakterientest mit Vibrio fischeri zur Bestimmung der akuten Toxizität (DIN 38 412 Teil 34 bzw. 341), der Vibrio fischeri-Wachstumstest zur Bestimmung der chronischen Toxizität (Zellvermehrungstest) (DIN-Enwurf, Stand März 1995), der Pseudomonas putida-Wachstumstest (Zellvermehrungstest) (DIN 38 412 Teil 8), Algentest (Scenedesmus-Zellvermehrungs-Hemmtest) (DIN 38412, Teil 33), SOS-Chromotest mit Escherichia coli (DIN-Entwurf) und der umu-Test mit Salmonella typhimurium (DIN 38 415 Teil 3). Die Etablierung eines Nitrifikations-Hemmtests ist geplant sowie der Einsatz anderer lumineszenter Bakterien (wie z.B. Photorhabdus luminescens oder Luxtransgener Bacillus sp. oder E. coli-Stämme) als Ersatz für den marinen V. fischeri.
Die Messung der Dosis/Wirkungsbeziehungen erfolgt in Mikrotitrationsplatten mittels Automaten (Photometrie, Fluorometrie und Luminometrie). Neue lasernephelometrische Verfahren werden erprobt. Die Testung der Automaten erfolgt mit Prototypen der Firmen MERLIN Diagnostika GmbH und OPAL JENA GmbH gemäß dem jeweiligen Entwicklungsstand. Durch ständigen Kontakt mit den Kooperationspartnern soll eine Optimierung der Gerätetechnik erzielt werden. Die Validierung erfolgt anhand von Referenztoxen und nativ belasteten Bodenproben.


Ergebnisse und Diskussion

Teilprojekt A: Miniaturisierung und Automatisierung von Ökotoxizitäts- und Mutagenitätstests - Definition der methodischen und technischen Anforderungen
Im vergangenen Bearbeitungsabschnitt wurden grundlegende Arbeiten zur Etablierung und Miniaturisierung der einzelnen Testverfahren durchgeführt. Die Testanforderungen, -designs, -layouts und -probleme wurden definiert. Die Zellvermehrungs- hemmtests mit Vibrio fischeri, Pseudomonas putida und Photorhabdus luminescens sowie die Lumineszenzhemmtests mit V. fischeri und Ph. luminescens liegen in miniaturisierten Verfahren vor. Die Validierung der miniaturisierten Tests wurde begonnen und anhand vorrangiger Fragestellungen wie Probenvor- und -aufarbeitung, Eignung der Systeme für bestimmte Probengruppen, Reproduzierbarkeit und Optimierung der Aussagefähigkeit der Testsysteme, gewichtet. Schwerpunkte bildete vor allem eine Modifikation der Auswertungsmöglichkeiten, um einer kinetischen Datenaufnahme gerecht werden zu können. Die Testung mit komplexen Umweltproben wurde systematisch neben der Testung von Referenz- und Einzelproben vorgenommen. Die Validierung mit unterschiedlichen Probenmaterialien und eine Zusammenstellung von Kenndaten (G und EC-Werten) dauert an.
Teilprojekt B: Humantoxikologische Testmethoden - Biological Effect Monitoring
Die Gewinnung und Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern gegen CYP1A-Isoenzyme konnten weitgehend abgeschlossen werden. Von den verschiedenen zur Verfügung stehenden Antikörpern sind einige selektiv für CYP1A1 und erkennen auch das orthologe humane Isoenzym. Andere Antikörper erscheinen für eine Kollektivbestimmung von CYP1A1 + CYP1A2 geeignet. Die laufenden Arbeiten befassen sich mit dem Einsatz dieser Antikörper in einem optimierten ELISA-Test. Hinsichtlich der Anwendung und Validierung des Testsystems wurden im Tiermodell Induktionsversuche mit real kontaminierten und künstlich beaufschlagten Böden (Referenztoxen) durchgeführt. Während die Verfütterung von real kontaminierten Böden eine Induktion des CYP1A1-Spiegels bewirkte, fanden sich nach oraler Aufnahme von Kontrollböden, die mit reinen 4- bis 7-Ring-PAK beaufschlagt wurden, keine Effekte auf den lebermikrosomalen CYP1A1-Spiegel. Zur Klärung dieses Phänomens wurden verschiedene Arbeitshypothesen aufgestellt und entsprechende Versuche begonnen.
Teilprojekt C: Automatenentwicklung für die Bodenprobentestung
Das in Zusammenarbeit mit der Firma STRATEC entworfene Konzept für einen Vollautomaten mit integrierter Schüttel-, Dispensier-, Washer- und Inkubationseinrichtung, photometrischer und luminometrischer Meßeinheit sowie externer Liquidhandlingstation basiert auf dem PlateRunner Entwicklungsprojekt, einem modularen Multitasking-System für die vollautomatische Bearbeitung von Mikrotitrationsplatten-Assays. Das Konzept für Mikroplattenbewegungen auf dem Automaten arbeitet nach dem Prinzip eines vollautomatischen Hochregallagers.
Teilprojekt D: Konstruktion, Herstellung und Erprobung eines Laser-Nephelometers für das Mikrotitrationsplattenformat
Es wurde ein Konstruktionsentwurf der optomechanischen Nephelometerbaugruppe des Lasernephelometers erstellt, eine Schaltung für die Regelung der Laserleistung sowie für die Detektorelektronik entwickelt und die Anpassung an einen A/D-Wandler vorgenommen. Eine erste Nephelometerbaugruppe wurde aufgebaut und eine Konstruktion der Aufrüstung zu einem Mikrotitrationsplattennephelometer vorgenommen. Parallel dazu erfolgten Entwürfe für eine neue, für die Lasernephelometrie besonders geeignete Mikrotitrationsplatte.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

EHRLICHMANN, H.; EISENTRÄGER, A.; KÜPPERS, D.; DOTT, W. Genotoxikologische Bewertung von Böden mit bakteriellen Testsystemen: Vergleich von Bodenextrakten, wäßrigen Eluaten und aufkonzentrierten wäßrigen Eluaten. 5. Kongreß der Gesellschaft für Hygiene und Umweltmedizin in Aachen; 6. - 8. März 1997
SCHMITZ, R.P.H., EISENTRÄGER, A., DOTT, W. Möglichkeiten und Problemfelder miniaturisierter und automatisierter Zellvermehrungshemmtests mit Prokaryonten. 5. Kongreß der Gesellschaft für Hygiene und Umweltmedizin in Aachen; 6. - 8. März 1997
SCHMITZ, R.P.H., EISENTRÄGER, A., DOTT, W. Wachstumskinetiken unter Schwermetalleinfluß - stoffspezifische und coergistische Effekte in miniaturisierten aquatischen Biotestsystemen mit Prokaryonten. Frühjahrstagung der Vereinigung für Allgemeine und Angewandte Mikrobiologie e.V. (VAAM) in Hamburg, 16. - 19. März 1997
SCHMITZ, R.P.H.; LINDVOGT, T.; EISENTRÄGER, A.; JACOBI, N., MÖLLER, M.; DOTT, W. Nutzungsbedingte Veränderung des toxischen Potentials von Schmierfluiden auf der Basis von synthetischen Estern. 5. Kongreß der Gesellschaft für Hygiene und Umweltmedizin in Aachen; 6. - 8. März 1997


Fazit

Die Arbeiten wurden gemäß der zeitlichen Vorgaben in allen Teilprojekten durchgeführt, bzw. sind im einzelnen dem Zeitplan voraus.