Projekt 05725/01

In-line-kalibrierbare Biomeßsonden für die Umweltanalytik

Projektdurchführung

Martin-Luther-Universität Halle-WittenbergInstitut für BiotechnologieFachbereich Biochemie/Biotechnologie
Kurt-Mothes-Str. 3
06120 Halle

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Vor der Projektbearbeitung waren nahezu keinerlei Konzepte zur in situ Kalibrierung, d.h. zur Kalibrierung von Chemo - und Biosensoren unmittelbar im Probenreservoir oder in einem Prozeßmedium bekannt. Diese für die meßtechnische Zuverlässigkeit, insbesondere bei der on line Überwachung von chemischen und biotechnologischen Prozessen mitentscheidende Frage setzt ein hohes Maß an Automatisierung voraus und erforderte u.a. zur Erreichung kurzer Ansprechzeiten die Konstruktion, Entwicklung und Optimierung von speziellen Tauchmeßsonden voraus. Eine weitere wichtige Problemstellung war die Integration von Bio- und Chemosensoren und von Probenahme- und konditionierschritten in kompakte und vollautomatische Mikrodurchflußanalysensysteme. Folgende Schwerpunkte wurden bearbeitet:( 1. ) Entwicklung von und Grundlagenuntersuchungen zu kapillaren Biomeßsonden und deren Einsatz zur präzisen und empfindlichen Bestimmung von Umweltkontaminanten. ( 2. ) Integration miniaturisierter Durchflußmeßsysteme zur in situ Regenerierung des biochemischen Sensorelementes und zur in line Kalibrierung, wobei eine Erhöhung der Zuverlässigkeit und der Richtigkeit der Meßergebnisse gegenüber herkömmlichen Biosensorsystemen erzielt werden sollte. ( 3. ) Ausarbeitung neuer Mikroverfahren zur in situ Probenahme und -konditionierung. ( 4. ) Integration von on line Probenahme- und anreicherungssystemen.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenZur Entwicklung kapillarer Biomeßsonden wurden kapillare Durchflußanalysensysteme realisiert, die die geplante Vorstufe zur Entwicklung von in situ konditionierbaren und - regenerierbaren Bio- und Chemomeßsonden darstellen. Davon ausgehend wurden neuartige kapillare Biosensorsysteme mit chemiluminometrischer und amperometrischer Signaltransduktion hergestellt und charakterisiert. Durch die in situ Erzeugung linearer Konzentrationsgradienten und definierter Signalfolgen gelingt nun die weitgehend absolute, d.h. kalibrierfreie Bestimmung umweltrelevanter Substanzen, wie z.B. Wasserstoffperoxid, Ammoniak, Schwefelwasserstoff und Kohledioxid.
In enger Kooperation mit dem IBA Heiligenstadt konnten auf der Basis miniaturisierter doppellumiger Kapillaren in situ kalibier- und konditionierbare Tauchmeßsonden für die Detektion von Phenolen, Schwefelwasserstoff/Hydrogensulphid, Schwefeldioxid/Sulphit, Ammoniak/Ammonium und Cyanid realisiert und validiert werden, die eine gegenüber herkömmlichen Sensoren höhere Meßempfindlichkeit, Linearität und Zuverlässigkeit aufweisen. Die Tauchmeßsonden wurden zunächst mit Fluoreszenz- und Chemilumineszenzdetektoren sowie mit photometrischen und amperometrischen Durchflußmeßzellen kombiniert. Die Weiterentwicklung führte zur Integration von faseroptischen Sensoren und miniatuisierten amperometrischen Detektoren in die Tauchmeßsonden. Der Einbau der Tauchmeßsonden in Durchflußanalysenanordnungen ermöglichte die Kombination mit weiteren enzymatischen Analytkonversionen. Begonnen wurde mit der Anwendung von dreiecksprogrammierten Mikrodurchflußtitrationen in denentsprechenden Durchflußanordnungen, wodurch absolut arbeitende Verfahren zur Bestimmung von Harnstoff, Ammoniak, Schwefelwasserstoff und Kohlendioxid realisiert werden konnten. Durch die neuartige digitale Mikrodurchflußtitration mit einer peroxidasemodifizierten Elektrode oder Chemilumineszenroptrode wurden Wasserstoffperoxid, Perborat und Percarbonat bestimmt. Durch Kombination der chemiluminometrischen Wasserstoffperoxiddetektion mit einem vorgeschalteten Gasdiayseschritt gelingt es, sehr empfindliche und darüber hinaus sehr selektive Wasserstoffperoxiddetektionen zu realisieren.
Um die entwickelten Meßsonden auf die in situ Analyse von Grund- und Sickerwasserproben anwenden zu können, wurde eine gepanzerte Einstechsonde mit einer Sikcerkammer entwickelt, in die das dopplelumige Sondensystem integriert ist. Gegenüber der herkömmlichen Analytik mit separater Probenahme wird insbesondere bei der Spurenanalytik die Gefahr der Kontamination der Probenlösung drastisch verringert. Durch die eingesetzten automatischen in line Kalibrierroutinen wird eine gegenüber herkömmlichen Sensoren deutlich verbesserte Präzision und Richtigkeit der Analysenergebnisse erzielt.Das Problem der automatischen in line Kalibrierung von Bio- und Chemomeßsonden wurde durch umfangreiche Arbeiten zur Entwicklung einer Steuersoftware und der dazugehörigen elektronischen Steuertechnik realisiert, wobei sowohl das Prinzip der gradientengesteuerten Durchflußtitration als auch das der sogenannten digitalen Titration, die eine gradientengesteuerte multiple Standardaddition darstellt, erfolgreich angewendet wurden.
Auch die Arbeiten zur Integration von Mikrotrennoperationen, wie z.B. der Hohlfasergasdialyse und -dialyse in die Bio- und Chemomeßsonden verliefen erfolgreich. Durch die integrierte in situ Kondi-tionierung der Probenlösungen gelingt eine schnelle Anpassung der Probenlösung an den jeweils angewandten Sensor.
Einige der besonders leistungsfähigen enzymatischen Phenolsensoren wurden mit einer Mikrodurchflußzelle zur Flüssigmembranextraktion kombiniert, um auch in komplizierter Probenmatrix arbeiten zu können. Es zeigte sich, daß insbesondere tyrosinasemodifizierte Elektroden außer auf eine Vielzahl von Phenolderivaten auch auf Cyanid, Sulphid und schwefelorganische Verbindungen ansprechen. Viele aromatische Verbindungen, wie z.B. Benzoesäure, Resorcinol und auch Phenolderivate mit blockierten 2-Positionen inhibieren die Tyrosinase. Andererseits sind tyrosinasemodifizierte Elektroden nur selten in der Lage, Phenolspuren mit ausreichender Empfindlichkeit zu detektieren. Die Flüssigmembranextrak-tion erwies sich als geeignet, polare und geladene Substanzen Ionen vollständig zurückzuhalten und zwischen Gruppen von Phenolderivaten aufgrund der unterschiedlichen pKS - Werte zu differenzieren. Darüber hinaus gelingt es, auch Phenolspuren schnell anzureichern und im nanomolaren Konzentrationsbereich zu bestimmen.
Die Festphasenextraktion wurde in ein vollautomatisches FIA (Flow Injection Analysis) - System für die Bestimmung von Herbiziden, d.h. von Acetylcholinesterasehemmern integriert.
Die umfangreich betriebene Entwicklung von Biosensorsystemen zielte auf einen leistungsfähigen meßtechnischen Zugang zu Umweltkontaminanten, wobei sowohl mit amperometrischen als auch mit chemiluminometrischen Signaltransduktoren gearbeitet wurde. Für die empfindliche Detektion von Wasserstoffperoxid, organischen und anorganischen Peroxiden, für Cholin, Acetylcholin, Xanthin, Hypoxanthin und NADH wurden jeweils sowhl ein amperometrisches und ein chemiluminometrisches Biosensorsystem entwickelt. Darüberhinaus wurden ein enzymatisch-chemiluminometrisches Verfahren zur Bestimmung von Phosphat und ein fluorimetrischenzymatisches Verfahren zur Bestimmung von Propylenoxid und Propan-1.2-diol entwickelt . Für die Bestimmung von Phenol und Catechol wurde eine große Zahl von tyrosinasemodifizierten Kohlekompositelektroden hergestellt. Durch Optimie-rung des Kompositbinders und des Trägermaterials konnten Elektroden mit verbesserter Betriebs- und Signalstabilität realisert werden. Als empfindliches Referenzverfahren wurde ein chemoenzymatisches Verstärkungssystem auf der Basis eines sehr stabilen Tyrosinasereaktors und der in line Derivatisierung mit o-Phenylendiamin entwickelt.
Die wesentlichen Zielstellungen des Projektes konnten erreicht werden. Die angestrebte Entwicklung eines enzymatischen Sulphitsensor führte in eine Sackgasse, da sich die einzusetzende Sulphitoxidase als für einen realen umweltanalytsichen Einsatz zu instabil und der alternative fluorimetrsichgasdialytische Sensor als deutlich überlegen erwies.


Ergebnisse und Diskussion

Die erzielten Ergebnisse sind in einem dem Anhang beigefügten ausführlichen Ergebnisbericht dargestellt und diskutiert.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Die erzielten Ergebnisse sind zum Teil in internationalen und referierten Fachzeitschriften publiziert und wurden durch Poster und Vorträge auf nationalen und internationalen Fachkonferenzen präsentiert. Aus der Projektbearbeitung sind zwei geprüfte Patente hervorgegangen.

Publikationen:
1. H. Lapp, U. Spohn und D. Janasek, An enzymatic chemiluminescence optrode for choline detection under flow injection conditions, Anal.Letters 29 ( 1996 ) 1 - 17.
2. H. Mana and U. Spohn, Selective flow injection procedures for the determination of nitrogen containing analytes by gasdialytic fluorimetric detection of enzyma -matically generated ammonia, Anal.Chim.Acta 325 ( 1996 ) 115 - 123.
3. M. Becker, B. Fuhrmann und U. Spohn, Selective determination of gas dialysable components in complex sample solutions using triangle - programmed coulometric titration in continuous flow systems, Anal.Chim.Acta 324 ( 1996 ) 115 - 123.
4. D. Janasek und U .Spohn, An enzyme modified detector for hydrogen peroxide and oxidase substrates, Sensors & Actuators B38-39 ( 1997 ) 291 - 294.
5. M. Becker, M. Martienssen, B. Fuhrmann und U. Spohn, Analysing nitrogen and sulphide elimination from leachate by coulometric continuous flow titration, Acta Biotechnologica 17 ( 1997 ) 39 - 50.
6. B. Fuhrmann und U. Spohn, An enzymatic amplification Flow Injection Analysis ( FIA ) system for the sensitive determination of phenol, Biosensors & Bioelec-tronics, 13 ( 1998 ) 895 - 902.
7. D. Janasek, U. Spohn und D. Beckmann, Novel chemiluminometric H2O2 sensors for the selectiveflow injection analysis, Sensors & Actuators, 1998, im Druck.
8. U. Spohn, B. Fuhrmann, E. Weckenbrock, E. Most, D.Janasek und D. Beckmann, In situ konditionier- und kalibierbare Sensorsysteme für die Umwelt- und Prozeßanalytik, in: Umweltdiagnostik. Miniaturisierte Systeme, Verlag Chemie, Weinheim, im Druck.
9. U. Spohn, Enzymmodifizierte Kohlepasteelektroden - ein neuer Weg zur reagenzfreien enzymatischen Analytik, Nova Acta Leopoldina Supplementum, 15 ( 1998 ) 153 - 172.

Patente:
1. U. Spohn, B. Fuhrmann, D. Beckamnn, E. Weckenbrock und E. Most, Verfahren zur In-situ- Kalibrierung von in die Probenlösung eintauchenden Sensoren, insbesondere Chemo - und Biosensoren, Patentschrift DE 197 15 441 C1, 10.04.97,erteilt 17.09.98.
2. U. Spohn, B. Fuhrmann, D. Beckmann, E. Weckenbrock und E. Most, Tauchmeßsonde zur Bestimmung permeabilisierender Analyte, Patentschrift DE 197 15 440 C1, 10.04.97, erteilt am 27.08.98.

Vorträge und Poster:
1. B. Fuhrmann und U. Spohn, An enzymatic amplification FIA system for the sensitive determination of Phenol, Poster auf 5th World Congress on Biosensors, Berlin, 03-05.06.1998.
2. U. Spohn, B. Fuhrmann, E. Most, E. Weckenbrock und D. Beckmann, The flow injection analysis of phenol traces based on an improved tyrosinase modified carbon paste electrode and a membrane enrichment step, Poster auf 5th World Congress on Biosensors, Berlin, 03-05.06.1998.
3. W. Bergmann und U. Spohn, Amperometric investigations of different peroxidases dissolved in aqueous electrolytes and immobilized in organic paste electrodes, Poster auf 5th World Congress on Biosensors, Berlin, 03-05.06.1998.
4. Fuhrmann und U. Spohn, Enzyme catalyzed microflow titrations, Vortrag auf 5th World Congress on Biosensors, Berlin, 03-05.06.1998.
5. Fuhrmann und U. Spohn, Kapillare FIA-Methoden zur Chemilumineszenzdetektion von Oxidoreduktase-Substraten und -aktivitäten, Poster auf 15. DECHEMA-Jahrestagung der Biotechnologen, 04.-06.03.1997, Münster
6. U. Spohn und H. Mana, Die fluorimetrische Detektion von Ammoniak und polaren Thiolen - ein neuer Weg zur enzymatischen FIA(Flow Injection Analysis) von Bioprozeßmedien, Poster auf 15. DECHEMA - Jahrestagung der Biotechnologen, 04.-06.03.1997, Münster.
7. W. Bergmann und U. Spohn, Mehrkanal-FIA-System zur Bestimmung und Charakterisierung von Enzymaktivitäten, Poster auf 15. DECHEMA-Jahrestagung der Biotechnologen, 04.-06.03.1997, Münster.
8. D. Janasek und U. Spohn, Bienzymmodifizierte Chemilumineszenz-Optroden, Poster auf 15. DECHEMA - Jahrestagung der Biotechnologen, 04.-06.03.1997, Münster.
9. B. Fuhrmann, U. Spohn, E. Weckenbrock, H. Stöber und D. Beckmann, Kapillare FIA mit Fluoreszenz- und Chemilumineszenzdetektion, 8.Heiligenstädter Kolloquium, Heiligenstadt, 07.10. - 09.10.1996, Vortrag.
10. D. Janasek und U. Spohn, Elektrochemische und optische Kohlepastesensoren - Ein Vergleich, 8.Heiligenstädter Kolloquium, Heiligenstadt, 07.10. - 09.10.1996, Poster.
11. U. Spohn, H. Mana, E. Most, E. Weckenbrock und D. Beckmann, Neue fluorimetrische FIA ( Flow Injection Analysis)-Verfahren auf der Basis schnell reagierender, wäßriger o-Phthalaldehydreagzien 9.Heiligenstädter Kolloquium, Heiligenstadt, 07.11. - 09.11.1998, Vortrag.
12. D. Janasek, U. Spohn und H. Lapp, An enzyme modified chemiluminescence detector for hydrogen Peroxide and oxidase substrates, 3th European Conference on Optical Chemical sensors and Biosensors, Zürich, 31.03. - 03.04.1996, Vortrag.
13. E. Weckenbrock, E. Most, D. Beckmann, B. Fuhrmann, H. Stöber und U. Spohn, Kapillarer Chemi- lumineszenzsensor für die Bestimmung von Wasserstoffperoxid und anderer Oxidationsmittel, Poster beim 3. Dresdner Sensor - Symposium, veröffentlicht in - Chemie - und Biosensoren Aktuelle Anwendungen und Entwicklungstrends, Dresden University Press, 1997, S.89 - 92.
14. D. Beckmann, E. Weckenbrock, E. Most, H. Stöber, U.Spohn und B. Fuhrmann, Enzymatisch - amperometrische Phenoldetektion nach Anreicherung mittels Flüssigmembranextraktion, Vortrag 3.Dresdner Sensor - Symposium, veröffentlicht in - Chemie - und Biosensoren Aktuelle Anwendungen und Entwicklungstrends, Dresden University Press, 1997, S.131 - 135.
15. B. Fuhrmann, U. Spohn, E. Most, E. Weckenbrock und D. Beckmann, Tyrosinase modifizierte Kohlekompositelektroden für die Umweltanalytik, 3.Dresdner Sensor - Symposium, veröffentlicht in - Chemie - und Biosensoren Aktuelle Anwendungen und Entwicklungstrends, Dresden University Press, 1997, S.157 - 160.
Die veröffentlichten und bisher nicht veröffentlichten Ergebnisse werden partiell den Firmen Mikroanalytische Systeme GmbH i.Gr. Halle und LDC GmbH Langewiesen zur Verfügung gestellt, die sich beide mit Betriebs- und Umweltanalytik befassen. Darüber hinaus sind 3 weitere Patentanmeldungen in Bearbeitung. Insbesondere bezüglich der gradientengesteuerten Mikrodurchflußtitrationen und Kalibrierverfahren sind weitere internationale Veröffentlichungen geplant.
Dies trifft z.T. auch auf die Weiterührung der fluorimetrischen Sensorsysteme zur Bestimmung umweltrelevanter Schwefelverbindungen zu, wobei hier demnächst eine Veröffentlichung zu gassensitiven Tauchmeßsonden eingereicht wird.


Fazit

Durch die dreieinhalbjährige Forschungs- und Entwicklungsarbeit konnten die Projektziele im wesentlichen erreicht werden. Das umweltanalytisch orientierte Biosensorprogramm führte zu neuen enzymatischen Sensor- und Analysensystemen. Während der Projektbearbeitung ist es gelungen, die in der Antragsphase entworfenen Kalibrieroutinen und die beabsichtigten Softwareentwicklungen in vollem Maße zu realisieren, so daß eine sehr leistungsfähige analytische Meßtechnik entwickelt werden konnte. Einen besonderen Schwerpunkt bildete die sehr erfolgreich verlaufene Entwicklung von in situ konditionierbaren und kalibbrierbaren Sensoren für die enzymatische und gasdialytische Detektion von umweltrelevanten Analyten. Auch die Integration moderner und schnell arbeitender Mikrotrennoperationen, wie z.B. der Gasdialyse, der Membranextraktion und der Festphasenextraktion in enzymatische Mikrodurchflußanalysen- und Biosensorsysteme konnte mit Erfolg realisiert werden.