The impact of nanomaterials on Tetrahymena thermophila1. EinleitungKatecholamine (Dopamin, Noradrenalin und Adrenalin) sind Neurotransmitter, die nicht nur bei Säugetieren gefunden werden können, sondern auch in unicellularen Protozoen wie Tetrahymena thermophila [1]. Diese Monoamine spielen eine wichtige Rolle bei der Steuerung und der Kooperation der Aktivitäten von spezialisierten Zellen. Viele Studien haben bestätigt, dass die Homöostase von Katecholaminen gestört werden kann und hohe Konzentrationen von Dopamin bis zum Zelltod führen können [2]. In der vorliegenden Studie werden die Auswirkungen von Nanomaterialien (nC60 Fulleren, C60(OH)24 Fullerenol) auf Katecholamine im Protozoon Tetrahymena thermophila untersucht. Die Veränderungen der Konzentrationen von Katecholaminen wurden mittels HPLC – ECD bestimmt. Um die mögliche Proliferation und Nekrose der Zellen zu identifizieren, wurden Resazurin – und Propidiumiodid – Assays durchgeführt, die jeweils die metabolische Aktivität [3] und Membranintegrität [4] kontrollieren sollten.Schlagworte : Tetrahymena thermophila; Katecholamin-Homöostase, Nanomaterialien, HPLC-ED; Resazurin; Propidiumiodid; Zellvitalitätsbestimmung.2. Material und Methoden2.1. T. thermophila KulturenT. thermophila wurde in 40 ml Proteose Pepton Hefeextrakt-Medium (PPY) kultiviert. Um eine Vorratskultur von T. thermophila zu erzeugen, wurden 250 µl einer Langzeitstammkultur in 40 ml frisches, steriles Medium, das PPY, Penicillin G, Amphotericin B und Dihydrostreptomycin-sesquisulfat enthielt, übertragen und bei 28 º C Grad über das Wochenende inkubiert. Zur Vorbereitung der Kulturen für Tests wurden 5 ml aus der Vorratskultur in 40 mL steriles PPY in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben übertragen und im Brutschrank bei 28 ° C Grad 1-2 Tage angezogen. Die Kultur wurde dann zentrifugiert und zweimal mit Osterhout Medium gewaschen. Danach wurden die Zellen in 40 – 50 ml Osterhout Medium resuspendiert. Die Zellen wurden mit einer Zählkammer gezählt.2.2. Vorbereitung von C60, C60 (OH)24 und Ruß20 mg C60-Fulleren-Pulver wurden in 20 ml Toluol mit einem Magnetrührer gelöst. Nach Zugabe des Toluols erschien die C60-Toluol Stammlösung als violett gefärbt und wurde in ein Becherglas mit 50 ml Osterhout Medium und 1, 5 ml Ethanol überführt. Die Mischung wurde mit einer Ultraschalltauchsonde bei ca. 70 W für 4 Stunden beschallt, bis die Toluol-Phase verschwunden war. Die nun gelblich-braune Dispersion wurde durch einen 0,7-µm Glasfaserfilter filtriert und im Kühlschrank aufbewahrt. Die Konzentration des wässrigen nC60 wurde mit einem Spektrophotometer bestimmt. Wasserlösliches C60(OH)24 wurde in Osterhout Medium vorbereitet. 3,8 mg C60(OH)24 Pulver wurden in 250 ml Osterhout-Medium aufgelöst. Hydrophober Ruß (Carbon Black, Printex 90), 5 mg, wurde auf 100 ml Osterhout Medium gegeben und für 30 Minuten im Ultraschallbad beschallt, um die Partikel zu dispergieren.2.3. Katecholamine Homöostase in T. thermophila Der Einzeller Tetrahymena thermophila wurde in 24 well (3 mL) Mikrotiterplatten für 24 und 48 h inkubiert. Die Dichte der Zellen belief sich auf 8,5 x 105 Zellen / ml Osterhout-Medium. Von beiden Nanomaterialien nC60 und C60(OH) 24 wurden je 1 mL in der gleichen Konzentration (15,5 ppm) zu den Zellen hinzugefügt. Nach der Inkubationszeit wurden 1,5 ml der Zellen (1,7 x 106 cells/ml) aus jedem Well zur Festphasenextraktion (SPE-Kartusche) entnommen. Das Verfahren wurde der Herstellervorschrift (ClinRep ® HPLC Komplett-Kit, Recipe, München, Deutschland) nachempfunden. Die Technik besteht aus 3 Schritten: Extraktion, Waschen und Elution. Zur Extraktion werden 1,5 ml der Zellen, 1,4 ml Tris-Puffer und 200 µl Na2S2O7-Lösung wurden in Nunc Zentrifugenröhrchen gegeben und mit einer Ultraschalltauchsonde (Bandelin Sonopuls GM 70, Deutschland) bei 10 Zyklen à 20 Sekunden die Zellen lysiert. Danach wurden 400 µl des Internen Standards DHBA zu allen Proben gegeben und für 2 Minuten bei 3000 U/min zentrifugiert. Der Überstand der zentrifugierten Proben wurde mit einer 2,5 ml Spritze entnommen. Die Proben wurden durch ein 1 µm Filter in die SPE Kartusche für Katecholamine (RECIPE ®) gefiltert, die 22 mg spezielles Al2O3 in 0,5 ml 2M Tris-Puffer enthält. Alle SPE-Kartuschen wurden für 15 Minuten gevortext, um die Katecholamine an die Oberfläche des Al2O3 zu binden. Die flüssige Phase der Proben wurde auf einer VakuumSPE- Kammer (Supelco TM visiprep DL, USA) entfernt. Anschließend wurden die Proben 3-mal mit je 1 ml Waschlösung gewaschen und danach mit Vakuum leergesaugt. 160 µL einer Elutionslösung (Recipe) wurde auf jede SPE-Kartusche übertragen und an deren Ausgang kleine PP-Elutionsröhrchen unter Verwendung von Parafilm befestigt. Die SPE- Kartuschen wurden für 10 Minuten gevortext und dann für 4 min bei 2000 U / min zentrifugiert. Anschließend, wurden die Proben in PP-HPLC-Vials überführt und mittels HPLC-ECD analysiert. Die HPLC-ECD – Anlage bestand aus einer GP40 Gradientenpumpe, ED 40 elektrochemischem Detektor mit eingestelltem Potential von + 0,7 V gegen Ag / AgCl und einem ACS50 Autosampler (Dionex Corporation, 1228 Titan Way, Sunnyvale, CA). Als Chromatographiesäule wurde „Clin Rep ® Katecholamine in Plasma (Recipe)“ verwendet. Es erfolgt eine isokratische Chromatograpie mit Mobiler Phase für Katecholamin Analytik (Recipe) bei einer Flussrate von 1 ml/min u. 30 º C bis zu eine Laufzeit v. 15 Minuten.2.4. Zellvitalitätsbestimmung auf Tetrahymena thermophilaDie Exposition von T. thermophila wurde in 24 well Mikrotiterplatten für 6h, 24 h und 48 h durchgeführt. Zunächst wurden die Zellen zentrifugiert (300 x g, 5min), 2-mal mit Osterhout – Medium gewaschen und in der Zählkammer gezählt. Die Dichte von Tetrahymena thermophila Kulturen wurde mit Osterhout Medium angepasst, um mindestens 10 5 Zellen in 487, 8 µL zu erhalten. Unterschiedliche Konzentration von nC60, C60(OH)24 (1,94, 3,88, 7,75 und 15,5 ppm) und Carbon Black (6,25, 12,5, 25 und 50 ppm) wurden in die 24 Well Mikrotiterplatten transferiert, die 487, 8 µL/Well der Zellen enthielten. Unbehandelte Zellen wurden als Kontrollgruppe verwendet. Alle Proben wurden in 4 Wiederholungen vorbereitet. Nach der Einwirkzeit (6h, 24 h und 48 h) wurden 100 µl aus jeder Vertiefung der 24iger Mikrotiterplatten in schwarze und transparente 96 Polypropylen – Mikrotiterplatten für die Zellvitalitätsbestimmung übergeben. Schwarze 96-Well-Platten wurden für Propidiumiodid und transparente 96-Well-Platten für Resazurin verwendet. 20 µL des Propidiumiodid wurde in die schwarzen 96-Well-Platten gegeben und 50 µL des Resazurin wurden in die transparenten 96 Well-Platten übertragen. Zunächst wurden die Platten mit dem Schüttler für 2 Minuten bewegt und dann 30 Minuten bei 28 º C inkubiert. Nach der Inkubation erfolgte die Messung unter Verwendung eines Fluoreszenz Mikroplatten-Readers bei Wellenlängen von 535 nm (Anregung), 590 nm (Emission) für beide Fluoreszenzfarbstoffe.3. Ergebnisse Die Katecholamin-Analyse mittels HPLC-ECD in Tetrahymena thermophila ergaben hohe Dopaminspiegel in der Kontrollgruppe und der Gruppe, die Nanomaterialien ausgesetzt war (Abb. 2 b, c, d und Tab.1). Die höchste Dopaminmenge wurde in Tetrahymena -Zellen erkannt, die auf nC60 Fulleren (2461, 75 pg / mL) und nC60(OH)24 Fullerenol (2223,58 pg / mL) in 1,7 x 106 Zellen / ml ausgesetzt werden. Die höchsten Noradrenalinmengen erschienen in den Zellen, die mit nC60(OH)24 behandelt wurden, und die niedrigste Menge wurde in der Kontrollgruppe präsentiert (unbehandelte Zellen). Das Adrenalin wurde in den Zellen in kleinsten Mengen (Tab. 1) entdeckt. Die Verweilzeit der Tetrahymena – abgeleitet Katecholamine stimmte mit authentischen Standards, damit weitere Annahme, dass die Identifikationen richtig waren. Die Standardabweichungen für alle Katecholamine in der Kontrollgruppe waren unterschiedlich im Vergleich mit Katecholaminen in den behandelten Zellen. Der Variationskoeffizient reichte von 0, 19% (unbehandelte Zellen) bis zu 11, 90% (behandelte Zellen). Für alle Proben wurden Wiederfindungen im Bereich von 40 bis 68% gefunden (Tabelle II). Die Fluoreszenzfarbstoffe (Propidiumiodid und Resazurin) zeigt Reduzierung der Lebensfähigkeit der Zellen bei geringen Konzentrationen (1, 94 und 3, 88 ppm) von nC60 und C60(OH)24. Je länger die Expositions-Zeit gegenüber den Nanomaterialien, desto höhere Toxizität und damit weniger Zelllebensfähigkeit wurde mit den beiden Farbstoffen (Abb.3.A und B) identifiziert. Es gab keine Unterschiede in Zell-Antworten für beide Farbstoffe bei höherer Konzentrationen von Nanomaterialien (7,75 und 15,5 ppm). Fullerenol C60(OH)24 erscheint mehr toxisch für die Zellen als Fulleren nC60, was sich durch erhöhte Werte für PI und erniedrigte Werte für AB RFU Werte ausgedruckt (Abb.3.A und B). Der höchste Verlust der Lebensfähigkeit im Vergleich zu nicht – behandelten Zellen wurde durch C60(OH) 24 nach 24 Stunden Exposition verursacht. Der Verlust von Lebensfähigkeit der Zellen wurde in Gegenwart von Carbon Black nach 6 h Inkubation beobachtet, was mit höheren RFU-Werten für Propidiumiodid korreliert. Die Ergebnisse für die Zellentwicklungsfähigkeitsanalyse mit Resazurin in allen Proben unterschieden sich nicht signifikant untereinander (Abb. 3 A, B, C).4. Diskussion Das Ziel der aktuellen Studien ist es, die Auswirkungen von Nanomaterialien auf bestimmte Organismen am Beispiel von Tetrahymena thermophila zu bewerten. Zusammen mit dem immer verbreiteteren Umgang mit Nanomaterialien, wachsen die Bedenken vor den schädlichen Nebenwirkungen von Nanomaterialien. In dieser Arbeit wurde Katecholamin-Homöostase und die mögliche Proliferation und Nekrose der Einzeller untersucht. Zusammenfassend lässt sich aus den beiden durchgeführten Studien schlussfolgern, dass das Fulleren nC60 und das Fullerenol nC60(OH) 24 in einer Konzentration bei 15,5 ppm die zunehmende Bildung von Katecholaminen verursacht. Weiter wurde ein Verlust der Zelllebensfähigkeit in geringeren Konzentrationen (1,94 und 3,88 ppm) mit den beiden Nanomaterialien ermittelt. Die geringere Toxizität in höheren Konzentration des Nanomaterialien lässt sich dadurch erklären, dass Tetrahymena ein Partikel fressender Organismus ist. Seine Vakuolen kann die Nanopartikel unterschiedlich gut aufnehmen. In anderen Worten, dieser Organismus scheint durch die Aufnahme und Speicherung die schädlichen Nanopartikel zu sequestrieren und damit deren Toxizität zu reduzieren[5, 6, 7]. Zwar ist es bekannt, dass höhere pathologische Dopaminspiegel umgekehrt zu indirektem oxidativen Stress durch die Bildung von Dopamin-Oxidationsprodukten führen können [8], dennoch müssen die weitere Studien beweisen, dass Nanomaterialien direkt die Katecholamin-Homöostase stören. Es erscheint erforderlich, entsprechende Untersuchungen nicht nur in der logarithmischen Wachstumsphase von Tetrahymena, sondern auch in frühen und späten stationären Phase durchzuführen.