Projekt 13141/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: ICBio: Rekombinante Esterasen für die Feinchemie

Projektdurchführung

Universität Greifswald Institut für Biochemie Biotechnologie & Enzymkatalyse
Felix-Hausdorff-Str. 4
17487 Greifswald

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Enzymatische Prozesse, insbesondere stereoselektive Hydrolysen und Synthesen gewinnen in der modernen Feinchemie ständig an Bedeutung. Enzymatische Reaktionen können im Vergleich zur chemischen Katalyse häufig unter milderen Bedingungen bezüglich der Verwendung von organischen Lösungsmitteln und solcher Prozessparameter wie Temperatur, Druck und pH-Wert durchgeführt werden. Ein weiterer ökologischer Vorteil von Biokatalysatoren beruht auf der Eigenschaft der Enzyme, eine Vielzahl von Reaktionen stereo- und enantioselektiv zu katalysieren, sodass mehrstufige Synthesen mitunter verkürzt, Ausbeuten gesteigert und Nebenprodukte minimiert werden können. Biokatalytische Prozesse haben also ein erhebliches Potenzial zur Ressourcenschonung und Umweltentlastung. Der erhebliche Zeitdruck (time to market) unter dem neue Prozesse etabliert werden müssen, macht eine lang angelegte Suche nach dem geeigneten Enzym im Vorfeld der Prozessplanung unmöglich. Deshalb geht der Trend zur Vorhaltung einer Sammlung verschiedener Enzyme, die in einem durchmusterungsfähigen Format abgelegt sind. Diese Banken (Kits) lassen sich sehr schnell auf das Vorhandensein eines geeigneten Enzyms untersuchen. Die Nachfrage namhafter Industrieunternehmen nach neuen Esterasen/Lipasen belegt, dass das vorhandene Angebot nicht ausreichend ist. Entsprechend ist es das Ziel des Verbundprojekts und insbesondere der BRAIN AG eine umfangreiche, hochdiverse und charakteri-sierte Enzymbank aufzubauen, um sich in diesem Marktsegment zu positionieren.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenFolgende Methoden wurden von Projektpartner I angewendet: Amplifikation, Klonierung und Sequenzierung von Esterase-Genen, Überexpression von Esterase-Genen, Fermentation, Proteinanalytik, Proteinreinigung, Untersuchungen zur Enzymstabilität und Enzymcharakterisierung mittels spektrophotometrischer Tests. Bei Projektpartner II wurden folgende Arbeitsschritte durchgeführt: Optimierung der Kultivie-rung der PLE in E. coli durch Chaperon-Coexpression, Identifizierung der Aminosäuresequenz der ?- und ?-Untereinheiten der PLE mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie, Identifizierung der Nukleotidse-quenz der ?- und ?-Untereinheiten der PLE mittels mRNA-Isolierung und cDNA-Synthese, Herstellung und Charakterisierung der PLE-Mutanten, Aktivitäts-Screening von Enzymextrakten der Firma BRAIN mit Hilfe eines pH-Assays, enzymatische Hydrolyse industriell relevanter Esterverbindungen mit ausgewähl-ten Enzymen, Entwicklung der Chiralanalytik (GC, HPLC). Die Aufgaben von Projektpartner III waren: Einordnung der Esterasesequenzen in die LED (lipase esterase database) mittels BLAST, Identifizierung möglicher Template über homologe Familien der LED, Erstellen von Homologiemodellen mit MODELLER über Multisequenzalignment über homologe Familien der LED, Bewertung der Homologiemodelle mit ProCheck und ProSa, Substrat-Dockung über Kombination aus molekularem
Docking (FlexX) und molecular mechanics (Amber9).


Ergebnisse und Diskussion

Im Projektteil Schweineleberesterase (PLE) wurden zunächst durch MALDI-TOF-TOF-Analyse Unterschiede im Peptidspektrum der Isoenzyme festgestellt und daraus abgeleitete Aminosäureaustausche in das Gen der -rPLE eingeführt. Ausgewählte Varianten zeigten deutlich erhöhte Enantioselektivitäten gegenüber ausgewählten Substraten im Vergleich zur -rPLE. Ausgehend von der mRNA aus Schweinele-ber gelang es nach Umschreibung in cDNA vier Klone zu identifizieren, die deutlich veränderte Sequen-zen (vier bis 21 Aminosäureaustausche) als die -rPLE aufweisen. Alle Esterasevarianten wurden in E. coli Origami mit Chaperonen coexprimiert und biochemisch charakterisiert. Zwei Klone zeigen deutlich erhöhte bzw. umgekehrte Enantioselektivitäten. Zusätzlich wurden Protokolle zur Aufreinigung und Kris-tallisation der PLE entwickelt.
Im Projektteil rekombinante Herstellung und Charakterisierung von Esterasen/Lipasen aus dem Metage-nom wurde für 13 priorisierte Enzyme die Klonierung bzw. Umklonierung des Gens und die Überexpression begonnen. 11 Kandidaten konnten über Expressionsstudien im 200 ml Schüttelkolben-Maßstab und 1,5 l Fermentation bis in den 10 l Maßstab geführt werden. Weitere Arbeiten befassten sich mit der Rei-nigung und Charakterisierung der Enzyme hinsichtlich Temperatur-Optimum sowie Thermo- und pH-Stabilität. Die von Projektpartner BRAIN zur Verfügung gestellten 80 Esterasen und zwei Lipasen wurden vom Projektpartner TCB zunächst mit einem Hochdurchsatz-Screening System unter Einsatz eines pH-Assays auf ihre Aktivität gegenüber industriell-relevanten Substraten durchmustert. Die Stereoselektivität aktiver Enzyme wurde anschließend in Reaktionsansätzen im Milligramm-Maßstab unter Verwendung neu entwickelter Methoden zur GC-Separation der Enantiomere untersucht. Dabei wurden für die Hydrolyse von cis-3,5-Diacetoxycyclopent-1-en vier Biokatalysatoren identifiziert, die einen Enantiomerenüberschuss der Produkte von über 96 %ee und einem Umsatz von bis zu 100 % ermöglichen, wobei drei En-zyme eine (-)-Präferenz zeigten und eine Esterase bevorzugt das (+)-Enantiomer bildete. Dies konnte in präparativen Reaktionen bestätigt werden. Die erhaltenen optischen Reinheiten liegen deutlich über den besten literaturbekannten Enzymen. Folglich belegen diese Ergebnisse die Bedeutung der Ressource des Metagenoms zur Identifizierung neuer und hochselektiver Biokatalysatoren.
Im Projektteil Modelling wurden Verbundpartner III 40 nicht-redundante Sequenzen für neue Esterasen übermittelt, die der prädiktiven Strukturanalyse durch Homologie-Modellierung und docking-Studien dienten. Die sequenzierten metagenomischen Esterasen wurden von Projektpartner III gegen die LED (lipase esterase database) geBLASTet und in homologe Familien eingeordnet. Für 23 der 41 Ausgangssequenzen (56 %) ließen sich Homologiemodelle erstellen. Für die anderen 18 Sequenzen konnte kein ausreichend homologes Protein mit aufgeklärter Struktur gefunden werden, um die Erstellung eines Homologiemodells zu ermöglichen. Von diesen 23 Homologiemodellen sind 11 von guter, 8 von mäßiger und 4 von schlechter Qualität. Anhand der 15 im Projektantrag beschriebenen sekundären und tertiären Alkoholen, und der Carbonsäuren wurden für die modellierten Enzyme mittels voll flexiblem Docking biochemische Profile erstellt. Im Lauf des Projekts wurden diese Profile um vier Substrate erweitert. Bei Vergleich von biochemischen Profilen guter Modelle mit experimentellen Daten vom Verbundpartner I konnte eine Korrelation von 75 % erreicht werden.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Im Rahmen des Projekts wurde an einer Vielzahl von Fachvorträgen auf nationalen und internationalen Kongressen und Messeveranstaltungen zur Verbreitung der Ergebnisse teilgenommen. Darunter sind z. B.: Biotechnika 2005 und 2007, Multi-Step Enzym Catalyzed Prozesses (MECP) 2006, Protein Design and Evolution for Biocatalysis 2006, Biosperspectives 2006 und 2007, German Conference on Bioinformatics 2006, der Besuch des Molecular Modelling Workshops und die Teilnahme an der 4th Oulu Sum-mer School in Bioprocess Engineering.


Fazit

Im Projektverlauf wurden alle relevanten Methoden zur Erreichung eines wichtigen Ziels des Verbunds etabliert und erfolgreich angewendet: die rasche und zuverlässige Bereitstellung in Bezug auf Substrat-spektrum und Stereoselektivität charakterisierter Enzymbanken. Mit diesem Portfolio sollte eine Realisierung biokatalytischer Verfahren wesentlich vereinfacht sein, da sowohl die Identifizierung geeigneter En-zyme, die zudem rekombinant herstellbar sind, als auch Informationen zur Aktivität und Stereoselektivität verfügbar sind.
Für die Schweineleberesterase ist insbesondere durch die optimierte Expression ohne Bildung von inclusion bodies durch Chaperon-Coexpression mit einem Produktionsverfahrens zu rechnen sofern die Probleme in der Maßstabsvergrößerung bei der Hochzelldichtekultivierung gelöst werden können.