Projekt 13071/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: InnovationsCentrum Biokatalyse ICBio: Entwicklung einer Aktivitäts-charakterisierten Enzymbank für die Feinchemie auf Basis heterologer Expressionssysteme zur Beschleunigung der Realisierung nachhaltiger biokatalytis[…]

Projektdurchführung

Universität Greifswald Institut für Biochemie Biotechnologie & Enzymkatalyse
Felix-Hausdorff-Str. 4
17487 Greifswald

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Enzymatische Prozesse, insbesondere stereoselektive Hydrolysen und Synthesen gewinnen in der modernen Feinchemie ständig an Bedeutung, da diese Verfahren zu einer erheblichen Ressourcenschonung und Umweltentlastung führen können. Trotz großer Fortschritte in der Molekularbiologie und Enzymologie und dem exponentiell wachsenden Verständnis von Struktur-Aktivitätsbeziehungen von Biokatalysatoren, stößt die breite Einführung derartiger Verfahren in die industrielle Anwendung aufgrund der Nichtverfügbarkeit von großen Sets an Enzymen und deren Bereitstellung in industriell erforderlichen Mengen und Qualitäten auf erhebliche Barrieren. Diesen Grundproblemen soll durch die Verfügbarmachung neuer und neuartiger Lipasen/Esterasen in industriekompatiblem Format begegnet und somit der Transfer biokatalytischer Prozesse in nachhaltige industrielle Anwendungen ermöglicht bzw. beschleunigt werden.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenAls Ressource dient zum einen die bisher wenig erschlossene Biodiversität der nicht-kultivierten Bakterien durch direkte Klonierung der aus Umweltproben isolierten DNA (Metagenom). Die daraus resultierenden Enzyme sollen hinsichtlich ihrer Substratspezifität und insbesondere der Enantioselektivität zunächst etwa mit chiralen primären und sekundären Alkoholen sowie chiralen Carbonsäuren charakterisiert wer-den, die eine Relevanz für die industrielle Anwendung aufweisen. Durch die Etablierung verschiedener Expressionssysteme soll gleichzeitig die Plattform geschaffen werden, um das Auffinden eines effizienten Systems für die präparative Darstellung eines geeigneten Biokatalysators zu beschleunigen. Zum anderen wird die erstmalig klonierte und in reiner Form dargestellte Schweineleberesterase (PLE), welche bislang nur in Form schlecht charakterisierter bzw. reproduzierbarer Rohextrakte verfügbar war, als Ausgangspunkt für die Identifizierung neuer industrierelevanter biokatalytischer Prozesse dienen. Hierzu soll die Expression in der Hefe Pichia pastoris optimiert werden bzw. alternative Expressionssysteme eingesetzt werden. Zusätzlich werden Mutanten der PLE erzeugt. Die rekombinanten PLEs werden bezüglich ihres Substratspektrums charakterisiert und für ausgewählte Verbindungen biokatalytische Verfahren entwickelt (z. B. 2-tert-Butylmalonsäureester als Ausgangssubstanz für die Darstellung von tert-Leucin).


Ergebnisse und Diskussion

Im Projektverlauf wurden alle wichtigen im Projektantrag geplanten Ziele erreicht.
Das erste Teilprojekt des Durchmusterns von Plasmid- wie auch Cosmid/Fosmid-Metagenom-Bankenmittels eines Aktivitätstests ist mit der Identifizierung von über 500 primären Kandidaten mit lipolytischer Aktivität erfolgreich abgeschlossen worden. Das zunächst gesteckte Projektziel der Erstellung neuer Plasmid-Banken durch den Verbundpartner BRAIN ist dann aufgrund der hohen Zahl an primären Kandidaten mit lipolytischer Aktivität und der sich abzeichnenden breiten Diversität unter den Enzymen aufge-geben worden. Aus diesem Grund wurden die Arbeiten auf die weiteren Projektziele der Charakterisierung der Enzyme und die Identifizierung der entsprechenden Gene konzentriert. Durch das Auffinden von Esterasen, die Ester tertiärer Alkohole umzusetzen vermögen und für die ein sehr großes industrielles Interesse besteht, konnte ein Schwerpunkt auf das Erstellen einer Enzymbank mit diesen wertvollen Enzymen gelegt werden. Zur schnellen und zuverlässigen Durchmusterung der von Projektpartner BRAIN zur Verfügung gestellten Esterasen/Lipasen als aktiv identifiziert werden. Die erfolgreiche Etablierung der Enantiomerenanalytik durch chirale Gaschromatographie erlaubte eine zeitnahe weitere Charakterisierung der Enzymbank. Folglich sind nunmehr alle relevanten Methoden zur Erreichung eines weiteren wichtigen Ziels des Verbunds etabliert worden: die rasche und zuverlässige Bereitstellung in Bezug auf Substratspektrum und Stereoselektivität charakterisierter Enzymbanken. Mit diesem Portfolio sollte eine Realisierung biokatalytischer Verfahren wesentlich vereinfacht sein, da sowohl die Identifizierung geeigneter Enzyme, die zudem rekombinant herstellbar sind, als auch Substratsynthesen und Informationen zur Aktivität und Stereoselektivität verfügbar sind. Im weiteren Verlauf des Vorhabens ist in Anbetracht der großen Zahl bereits gefundener aktiver Esterase/Lipase-Produzenten und der derzeit laufenden Klonierung und Überexpression weiterer Biokatalysatoren mit einer ganzen Reihe weiterer Hits (aktive und stereoselektive Enzyme für weitere Substrate) zu rechnen. Für die rekombinante Schweineleberesterase konnte durch Herstellung von Mutanten gezeigt werden, dass die Stereoselektivität teilweise erheblich von der Zahl und Art der Mutationen abhängt. Die Entwicklung fermentativer Verfahren (4 bzw. 10 Liter-Maßstab) ermöglicht trotz der niedrigen Expression in der Hefe Pichia pastoris die Bereitstellung aktiver rPLE im Kilo-Unit-Maßstab. Zusätzlich wurden Verfahren zur Aufarbeitung und Isolierung des Enzyms entwickelt. Ein entscheidender Durchbruch zur Herstellung der rPLE wurde durch die erstmalig erfolgreiche Expression in E. coli erzielt. Damit ist nun eine wesentlich einfachere und kostengünstigere Herstel-lung dieser Carboxylesterase möglich.
Die Bereitstellung geeigneter Biokatalysatoren, wie sie in diesem Verbundprojekt erreicht wurde, kann somit erheblich zur Einführung neuer biokatalytischer Prozesse beitragen, wenn dadurch das Auffinden eines geeigneten Enzyms erleichtert und die Suche verkürzt werden kann. Darüber hinaus sind fermentative Verfahren zur Herstellung rekombinanter Enzyme durch Überexpression wesentlich produktiver im Vergleich zur Kultivierung von Wildstämmen, die zudem meist mit einer wesentlich aufwändigeren Aufreinigung verbunden ist. Folglich können durch die angestrebten Produktionsmethoden weitere Ressourcen in der Herstellung der Biokatalysatoren eingespart werden.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Im Rahmen des Projekts wurde an einer Vielzahl von Fachvorträgen auf nationalen und internationalen Kongressen und Messeveranstaltungen zur Verbreitung der Ergebnisse teilgenommen. Darunter sind z. B.: Biocat 2002, Applied Biocatalysis, Osnabrücker Umweltgespräche Nachhaltige Biokatalyse, Metagenomics 2003, BioTrans 2003 und BioTechnica 2003, BioPerspectives 2004


Fazit

Im gesamten Projektverlauf wurden alle relevanten Methoden zur Erreichung eines wichtigen Ziels des Verbunds etabliert und erfolgreich angewendet: die rasche und zuverlässige Bereitstellung in Bezug auf Substratspektrum und Stereoselektivität charakterisierter Enzymbanken. Mit diesem Portfolio sollte eine Realisierung biokatalytischer Verfahren wesentlich vereinfacht sein, da sowohl die Identifizierung geeigneter Enzyme, die zudem rekombinant herstellbar sind, als auch Substratsynthesen und Informationen zur Aktivität und Stereoselektivität verfügbar sind. Für die Schweineleberesterase ist insbesondere bei ei-ner Expression ohne Bildung von inclusion bodies mit einer schnellen Realisierung eines Produktionsverfahrens zu rechnen. Damit wäre die für die organische Synthese wichtigste Esterase in absehbarer Zeit in rekombinanter Form verfügbar.