Projekt 07255/01

Untersuchungen zu photosynthetischen Reaktionen in der ETC von Algen auf Schad- und Nährstoffeinflüsse aus der Fluoreszenzkinetik im Hinblick auf den Einsatz als Umweltsensor

Projektdurchführung

Christian-Albrechts-Universität zu KielForschungs- und Technologiezentrum Westküste
Hafentörn 1
25761 Büsum

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Das Projekt verfolgt hauptsächlich die Ziele, die umweltbeeinflussten Vorgänge aus Nähr- und Schadstoffzugaben in der photosynthetischen Fluoreszenzkinetik von Algen besser verstehen und somit auch gezielter einsetzen zu können (wie z.B. beim 1Hz-Fluorometer der Firma BBE) sowie den hier beschriebenen, noch wenig bekannten, Messverfahren (durch die Demonstration ihrer Leistungsfähigkeit) zum Einsatz in der Um-weltüberwachung und -forschung zu verhelfen. Im Rahmen der aktuellen Umweltproblematik ist es ein Ziel dieses Projekts, für die Auswirkung von Nähr- und Schadstoffen auf Algen mechanistische Erklärungen zu finden, die auf der Zuordnung dieser Wirkungen zu bestimmten Prozessen im photosynthetischen Apparat beruhen. Diese stützen sich hauptsächlich auf die Überprüfung der bisherigen Hypothese (Wirkung auf die zum Akzeptor-Pool von PS I gehörende Zeitkonstante t3) für Stickstoff (und Phosphat) und die mögliche Erweiterung und Modifizierung für die Wirkung anderer Stoffe. Ebenfalls wird die Untersuchung weiterer photosynthetischer Reaktionen auf Schadstoffzugaben im Messbereich von 0.05 bis 20 Sekunden in der Fluoreszenzkinetik vorgenommen. Die hierbei gewonnenen Zusammenhänge sollen dann neben ihrer wissenschaftlichen Aussage dazu benutzt werden, eine einfach zu handhabende leistungsfähige Messmethode aus den im Projekt benutzten Messverfahren zu entwickeln. Dies wird entweder in der Entwicklung eines modifizierten Rauschmessgeräts bestehen,oder aber in der Überarbeitung des 1Hz-Fluorometers für eine gezieltere Anregung unterschiedlicher Photosynthese-Komponenten.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenAuf der Diplomarbeit von Ralf Hintze aufbauend, wurden Messungen an der Alge Dunaliella salina vorgenommen, um weitere Voraussetzungen für das Projekt klären zu können. So wurde die Anstiegsphase der Kautsky-Kinetik bei unterschiedlichen Lichtintensitäten, mit und ohne DCMU-Einwirkung, auf die Algen überprüft. Es wurden ausführliche Vergleiche mit der Literatur bzgl. dieser Phasen angestellt und eine Deutung der aufgetretenen Zeitkonstanten versucht. Die Experimente zeigten, dass das Verhalten der schnellen Zeitkonstanten stark temperaturabhängig ist. Dies führte zu einer Temperaturstabilisierung der Messkammer und zu besser stabilisierten Algenaufzuchtbedingungen. Die Experimentierkammer wurde völlig neu gestaltet. Dies eröffnet die Möglichkeit, sehr flexibel verschiedene Signale von den Algen abzugreifen. Die Umstellung auf blaue LEDs in Anregungs- und Messlicht gestaltete sich sehr schwierig, da die verwendeten blauen LEDs eine sehr große Bandbreite aufweisen. In den meisten Kantenfiltern lösen sie außerdem Eigen-Fluoreszenz aus. Es mussten entsprechende Filterkombinationen ausprobiert werden, bis vertretbare Messungen möglich waren. Um neben dem Fluoreszenz-Signal über weitere Zugänge zur Photosyntheseaktivität der Algen (entsprechend dem Antrag (Kap. 4.2.1)) zu verfügen, wurden die Absorptionsänderungen von Lichtanregungen bei 820, 515 und 535 nm untersucht. Es ergaben sich aber keine befriedigenden Signal-/Rauschverhältnisse. So sind nur die 535 nm Messungen teilweise möglich sowie Messungen mit zusätzlichem dunkelrotem PSII-Licht. Um eine weitere Gütebestimmung mit unseren Messmethoden vornehmen zu können, wurden mit den überarbeiteten Aufbauten, laut dem Antrag (Kap. 4.2.4 - 4.2.6), Messreihen bei unterschiedlichen Lichtintensitäten an der Grünalge Dunaliella salina und der Braunalge Thalassiosira weissflogii durchgeführt. Hierbei kommen das 1Hz-Küvetten-Fluorometer, das PAM-Fluorometer, die Rauschanalyse und die Kohlenstoffassimilation mit der 14C-Analyse zum Einsatz. Die Aus-wertungen dieser Laborexperimente und einer Herbstausfahrt 1996 sind im Rahmen des Symposiums New Challenges for North Sea Research 1996 in Hamburg vorgestellt worden (Vanselow et al., 1997). Auf einer weiteren Ausfahrt in der Deutschen Bucht mit dem FS Heincke vom 3.4. bis 17.4.1997 wurde das 1Hz-Küvetten-Fluorometer mit dem PAM-Fluorometer von Walz verglichen und auf die im Labor er-mittelten Chlorophyll-Werte nach Lorenzen bzw. Jeffrey & Humphrey bezogen. Wir haben die 1Hz-Methode darüber hinaus auf Primärproduktions-Workshops in Zingst (1997) und Büsum (1998) vorgestellt und an Vergleichsmessungen teilgenommen. Auch wurde auf dem Stand der DBU zusammen mit BBE Moldaenke das Messsystem auf der Biotechnica 1997 dargeboten. Die ebenfalls eingesetzte Rauschanalyse bringt gute Ergebnisse, um Grundlagen zu schaffen, stellt also eine gute Ergänzung dar. Die Rauschanalyse selbst ist zwar elegant, aber nicht leicht verständlich und im hier verwendeten Zeit-bereich für den Einsatz in Messgeräten ungeeignet. Auch liefert diese Methode der Kurveninterpretation über die Summe von Exponentialfunktionen zwar keine eindeutigen Ergebnisse, dafür ist diese aber sehr flexibel einsetzbar, was Kurveninterpretationen noch ermöglicht, wenn alle anderen Verfahren be-reits versagen. Als Abhilfe wurde versucht die Fit-Algorithmen auf modellgestützte Target-Fits umzustellen. Dies geschah u.a. auf Basis eines in der Hansen-Gruppe (Biophysik) erstellten Fitprogramms. Bisher zeigen die verwendeten Differenzialgleichungsmodelle aber keine befriedigenden Ergebnisse. Die Kurven lassen sich aber mit dem Parallelweg-Modell immerhin derart nachvollziehen, dass dieses Mo-dell die Realität richtig nachbildet. Die Kultivierungsbedingungen für die Algenkulturen wurden ständig verbessert. Zusammen mit den Biologen des FTZ wurde ein Experimentierplatz um einen Turbidostaten (trübungsgeregelte Algenkultivierung) herum aufgebaut. Experimente mit Nährstofflimitierung (Nitrat, Phosphat und Silikat) wurden durchgefahren und die Ergebnisse der Rauschanalyse und des Durchfluss-1Hz-Fluorometers diskutiert.


Ergebnisse und Diskussion

Ergebnis dieses Projekts ist sowohl die Eignung des 1Hz-Fluorometers zur Bestimmung des Pigmentgehalts, wie Chlorophyll a Gehalts, in Meerwasserproben, als auch die Brauchbarkeit des 1Hz-Signals zur Bestimmung der Primärproduktionsrate von Algen. Das neue 1Hz-Küvetten-Fluorometer bleibt trotz der Parametererweiterungen im Messbereich erheblich empfindlicher als das PAM-Fluorometer. Die Ergebnisse zeigen auch, dass das 1Hz-Signal nach der Verrechnung über eine empirisch gefundene Formel nicht direkt die Kohlenstoffassimilation der Algen bei unterschiedlichen Lichtintensitäten anzeigt. Es zeigt sich eine gute, dem PAM Gerät vergleichbare, Empfindlichkeit auf Änderungen des physiologischen Zustands der Algen im Turbidostaten. Die Ergebnisse zeigen eine direkte Abhängigkeit des 1Hz-Signals von den Photosyntheseparametern in diesem Zeitfenster (A0, A1a, A1b, A2, t0, t1a, t1b und t2). Hierbei erzeugten vor allem die 1Hz-Dunkelrotlichtanregungen über PSI erheblich deutlichere Signale als die Blaulichtan-regungen über PSII. Eine genaue Auswertung konnte aus Zeitgründen in diesem Projekt nicht abgeschlossen werden, wird aber in der Dissertation Hintze (1999) nachzulesen sein.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Es sind verschiedene Beiträge in unterschiedlichen Medien erschienen. Diese reichen von einer Internet-Seite (http://www.uni-kiel.de:8080/ftzwest/ag2/projekte/biophy.htm), einem Zeitungsartikel (Dithmarscher Landeszeitung vom 16.1.1997, S. 15), einem Artikel im Technologie Dialog Nr. 24 (Magazin der Technologiestiftung Schleswig-Holstein) S. 20, FTZ-Jahresberichtsbeiträgen 1997, 1998, 1999, einem Beitrag zu einem chinesisch-deutschen Workshop, einem Beitrag in der FAZ Biotechnologie-Beilage vom 13.10.98 und in den Rostocker Meeresbiologischen Beiträgen bis hin zu einem Poster auf dem Internationalen Symposium New Challenges for North Sea Research in Hamburg mit den dazugehörigen Artikeln in den Berichten des Zentrums für Meeres- und Klimaforschung oder in der Deutschen Hydrographischen Zeitschrift Vol. 49 und auf der Biotechnica 97.


Fazit

Die hier gezeigten Beispiele zur Anwendbarkeit der Hz-Fluorometer zeigen die ganze Vielfalt der Einbindungsmöglichkeiten der (im Verhältnis zu Wachstums- und Verhaltensänderungen sehr schnell auf Milieuänderungen reagierenden) photosynthetischen Fluoreszenzkinetik in die Nutzung von Mikroalgen als Biotestindikatoren. Algen-Fluorometer, wie das 1Hz-Fluorometer, sind damit sehr gut zur Gewässer- und Abwasserüberwachung geeignet. In Zukunft ist neben der Weiterentwicklung dieser Messmethoden, de-ren Einsatz in der biotechnologischen Forschung, z.B. zur Optimierung der Naturstoffproduktion aus Mikroalgen, von vielversprechender Bedeutung.