Projekt 04343/01

Vergleichende Bewertung von umu-Test und Ames-Test anhand von Untersuchungen chemischer Monosubstanzen und Abwasserproben. Ermittlung des Einflusses störender Parameter

Projektdurchführung

AMMUG,Arbeitskreis Molekulare MechanismenUmweltbedingter Gentoxizität
Obere Zahlbacher Str. 63
55101 Mainz

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Ziel des Vorhabens war die Etablierung und Bewertung eines Verfahrens zur schnellen und kostengünstigen Erkennung von Gentoxinen in Umweltproben. Darüberhinaus wurde der Einfluß der Sterilfiltration auf das Testergebnis ermittelt. Ein weiterer Abschnitt befaßte sich mit der Frage, ob im Testgut vorhandene wachstumsfördernde Stoffe, wie z.B. Histidin, die Interpretation des Testergebnisses beeinträchtigen können.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDas Projekt gliederte sich in drei Phasen: Zunächst wurde die Frage geklärt, inwieweit umu- und Ames-Test in ihren qualitativen Aussagen übereinstimmen. Die Erstellung einer grundlegenden vergleichenden Datenbasis durch Untersuchung von Substanzen unterschiedlicher chemischer Klassen in Form von Konzentrations-Wirkungskurven ermöglichte die Ermittlung von Sensitivitäts- und Spezifitätskenndaten (u.a. durch Vergleich mit Karzinogenitätsdaten aus Nageruntersuchungen) und einen Vergleich mit Daten des Ames-Tests aus der internationalen Literatur. Im zweiten Abschnitt wurde untersucht, ob sich die bei der Testung von Monosubstanzen erzielten Kenndaten in der Praxis auf Umweltproben übertragen lassen. Der dritte Untersuchungsabschnitt beschäftigte sich mit dem Einfluß wachstumsfördernder Stoffe auf die Ergebnisse der Gentoxizitätstests.


Ergebnisse und Diskussion

Die vergleichende Betrachtung von 125 Monosubstanzen unterschiedlicher chemischer Klassen zeigte eine Übereinstimmung der beiden Verfahren von 88%. Bei Ausklammerung der Substanzen, die in einem der beiden Tests keine durchgehend pos. bzw. neg. Ergebnisse lieferten, ergab sich sogar eine Gesamtübereinstimmung von 93%. Nach Reduktion des Ames-Tests auf die Teststämme TA98 und TA100 (unter Nichtberück-sichtigung des Stammes TA102), fiel der Prozentsatz der in dieser Studie verwendeten und als Ames-mutagen detektierbaren Substanzen um ca. 17%.
Ein Vergleich der umu-Gentoxizität mit der Karzinogenität war mit 90 Substanzen möglich. Dabei zeigte der umu-Test eine Sensitivität von 62%, die Spezifität betrug ca. 64%. Der positive Vorhersagewert beträgt 92%, d.h. ein positives umu-Testergebnis läßt in 92% der Fälle ein karzinogenes Potential der getesteten Substanz erwarten.
Die vergleichende qualitative Untersuchung von Abwasserproben in umu- und Ames-Test führte ebenfalls zur weitgehenden Übereinstimmung der beiden Testsysteme.
Die Sterilfiltration verschiedener Abwasserproben vor ihrem Einsatz im umu-Test führte gegenüber den nicht sterilfiltrierten Proben zu einer signifikanten Verminderung der Gentoxizität. Dies traf für jeden ver-wendeten Filtertyp (Celluloseacetat 0,22 µm und 0,45 µm, Polysulfon 0,45 µm und Nylon 0,45 µm) zu. Die Verminderung der Induktionsrate bei Verwendung eines Nylon- oder Polysulfonfilters gegenüber der Induktionsrate bei Verwendung des Celluloseacetat-Filters derselben Porengröße war ebenfalls signifikant. Bei bestimmten Abwasserproben ist demnach mit einer Beeinflussung der Probenmatrix zu rechnen. Letztere scheint bei Nylon- und Polysulfonfiltern am deutlichsten ausgeprägt zu sein. Die Untersuchungen mit dem als Modellgentoxin dienenden 2-Aminoanthracen bestätigen frühere Befunde über die Elimination polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe. Die ohne Vorbehandlung der Probe zu messende Gentoxizität war nach Sterilfiltration vollkommen verschwunden. Demnach kann es nicht ausgeschlossen werden, daß der Ames-Test, welcher mit sterilfiltriertem Testgut durchgeführt werden muß, Ergebnisse liefert, die nicht die tatsächliche Mutagenität der Abwasserproben widerspiegeln.
Die Anwesenheit von ansteigenden Mengen an Histidin im Testgut führte im Ames-Test gegenüber der Testung der gleichen Probe ohne Histidinzusatz zu einer zunehmenden Erhöhung der Revertantenzahl der Teststämme TA98 und TA100. Eine Erhöhung der Revertantenzahl des Stammes TA100 war auch in Anwesenheit von Histidinol zu beobachten. Histidinolphosphat und Imidazol-Essigsäure hatten dem-gegenüber keinen Einfluß auf die Höhe der Revertantenzahl. Diese Untersuchungen belegen, daß die Testung histidinhaltiger bzw. histidinolhaltiger, mutagenfreier Testansätze bis zum gewissen Grade zum Vortäuschen eines mutagenen Potentials führen kann. Die Gegenwart von Histidin bzw. Histidinol in gentoxinhaltigen Proben führte gegenüber den gleichen Proben in Abwesenheit dieser Metabolite ebenfalls zum deutlichen Anstieg der Induktionsraten in den betreffenden Konzentrationsbereichen. Die Er-gebnisse des umu-Tests sind unabhängig vom Gehalt an Histidin im Testansatz. Bei Umweltproben mit größtenteils unbekannter chemischer Zusammensetzung, die mit dem Ames-Test untersucht werden, sollte daher sichergestellt sein, daß kein Histidin in den Test eingebracht und so Mutagenität vorgetäuscht wird. Um Fehlinterpretationen im Ames-Test bei der Untersuchung komplexer Mischpollutionen zu vermeiden, sollten Histidin oder interagierende Formen von Histidin aus proteinhaltigem Untersuchungsmaterial bestimmt bzw. entfernt werden.
Ergebnisse des Forschungsvorhabens unter umweltrelevanten Gesichtspunkten
Durch die Möglichkeit der simultanen Testung von bis zu 96 Einzelbestimmungen auf einer Mikrotestplatte ist der umu-Test sehr kostengünstig durchführbar. Ein hiermit verknüpfter wichtiger ökologi-scher Gesichtspunkt ist auch das relativ kleine Abfallaufkommen, mit ca. 18 g pro Meßpunkt. Beim Ames-Test hingegen fällt pro Meßpunkt (2 Teststämme, 3fach-Bestimmung, ± S9-Zusatz) alleine 420 g Petrischalenabfall an. Dazu kommen Kunststoff-Sterilfilter und PPN-Röhrchen. Dies entspricht der mehr als 20fachen Menge des umu-Tests! Da nahezu alle verwendeten Materialien nach Testende durch Autoklavieren zu dekontaminieren sind, ergibt sich auch ein drastischer Unterschied im Energieverbrauch. Die Dauer des weitgehend automatisierbaren umu-Tests beträgt zudem nur ca. 7 Stunden (Ames-Test: 2 - 3 Tage); die Berechnung und Auswertung der Daten mittels EDV ist innerhalb weniger Minuten abgeschlossen. Bei einer vollständigen Untersuchung einer Testsubstanz oder eines Testwassers (nach DIN) ist bei beiden Testverfahren der Zusatz eines Homogenats aus Rattenlebern (S9) erforderlich. Im umu-Test werden pro Meßpunkt 2,2 µl dieses Homogenats verbraucht. Dies entspricht nur 5% des beim Ames-Test notwendigen Präparats, d.h. die Zahl der notwendigen Tierversuche kann bei Verwendung des umu-Tests um 95 % gesenkt werden.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Ergebnisse des Forschungsvorhabens wurden bereits in einer internationalen Fachzeitschrift publiziert (Mutation Res. 369 (1996) 129-145). Seit Dez. 1996 ist der umu-Test als der erste Gentoxizitätstest auf nationaler Ebene nach DIN standardisiert. Eine internationale Standardisierung nach ISO ist in Vorbereitung.


Fazit

Die in dieser Studie verwendete Mikroversion des umu-Tests eignet sich hervorragend sowohl zur Untersuchung chemischer Monosubstanzen als auch umweltrelevanter Proben, wie z.B. Mischpollutionen auf Gentoxizität. Der innerhalb eines Arbeitstages durchführbare Test zeichnet sich durch eine hohe Sensitivität, geringe Anfälligkeit gegenüber Störfaktoren und gute Umweltverträglichkeit u.a. durch drastische Reduktion des anfallenden Abfalls aus.